Ett alternativt tillvägagångssätt för provberedning med låg mobilnummer för TEM-analys
Summary
Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.
Abstract
Transmissionselektronmikroskop (TEM) ger information om den cellulära organisationen och ultra. Men TEM-analys av sällsynta cellpopulationer, särskilt celler i suspension, såsom hematopoetiska stamceller (HSC: er), är fortfarande begränsad på grund av kravet på ett högt cellantal under provberedning. Det finns några cytospin eller monolager metoder för TEM-analys från knappa prover, men dessa metoder misslyckas med att få betydande kvantitativa data från det begränsade antalet celler. Här är ett alternativ och ny metod för provberedning i TEM studier som beskrivs för sällsynta cellpopulationer som möjliggör kvantitativ analys.
En relativt låg mobilnummer, det vill säga 10.000 HSCs var framgångsrikt använts för TEM-analys jämfört med miljontals celler som normalt används för TEM studier. I synnerhet var Evans blå färgning utförs efter paraformaldehyd-glutaraldehyd (PFA-GA) fixering för att visualisera den lilla cell pellåt, vilket underlättade ingjutning i agaros. Kluster av många celler observerades i ultratunna sektioner. Cellerna hade en väl bevarad morfologi, och de ultra strukturella detaljer hos de Golgi komplexa och flera mitokondrier var synliga. Denna effektiva, lätt och reproducerbar protokoll tillåter provberedning från en låg mobilnummer och kan användas för kvalitativ och kvantitativ TEM-analys på sällsynta cellpopulationer från begränsade biologiska prover.
Introduction
Ultra-strukturella och sub-organell uppgifter om celler har huvudsakligen avslöjats av transmissionselektronmikroskop (TEM) undersökningar från vävnader eller cellpellets 1,2. Fasta bitar av vävnader kan lätt utnyttjas för elektronmikroskopiska studier. Men analyser TEM 1,3 på celler i suspension fortsatt utmanande och kräver höga cellantal, dvs miljontals celler. På grund av detta, ultra-strukturella analyser av sällsynta cellpopulationer i suspension, t ex hematopoetiska stamceller (HSCs), är inte lätta att bedömas. Flera försök för TEM-analys från knappa prover med cytospin eller monolager metoder misslyckas med att få betydande kvantitativa data från det begränsade antalet celler. Således, kravet på en hög cellnummer begränsar användningen av detta kraftfulla verktyg för att förstå de subcellulära ultra uppgifter om sällsynta cellpopulationer.
En viktig begränsning för TEM studier med ett begränsat antal cellsi suspension är lokaliseringen av cellerna för bearbetning och därmed TEM studier från begränsade celler med speciellt små storlekar fortsatt utmanande. Flera alternativa tillvägagångssätt har antagits för att motverka denna begränsning: BSA / bisakrylamid (BSA-BA) medierad polymerisation av cellsuspensionen, färgning av celler med ett färgämne för att göra dem synliga på en tunn film stöd inklusive täck, och TEM-analyser från cytospinberedningar 4-6. Emellertid var mycket begränsad framgång uppnåtts, eftersom mycket få celler återfanns i de avsnitt efter ultra-snittning. Den största utmaningen att identifiera glesa celler kvarstår på grund av cellmonoskiktet fortfarande mestadels osynlig i den stelnade gelén för sektionering. Dessutom kan cytospin framställning av celler ändra deras cellulära organisationen på grund av cellspridning och bräckligheten i cellstrukturen. Därför är dessa inneboende nackdelar motiverar en ny metod för att utföra TEM studier av sällsynta cellpopulationer med merkonsistens. För att övervinna detta problem har vi beskrivit en ny och alternativ provberedning metod för TEM studier från sällsynta cellpopulationer 7.
Här rapporterar vi en effektiv provberedning protokoll för att utföra TEM från knappa biologiska prover med konsekventa kvalitativa och kvantitativa resultat. Evans blue färgning utfördes efter fixering för att lokalisera en liten cellpellet från lågt antal celler, det vill säga, 10000 benmärgs hematopoietiska stam- och stamfaderceller som annars skulle ha förblivit osynliga, och pelleten bäddas in i agaros före dehydrering och harts inbäddning processer. Denna metod kluster cellerna tillsammans och möjliggör effektiv analys av ultrastruktur och subcellulär organisation av hematopoietiska stamceller (identifierade som Lin – Sca-1 + c-Kit + Flt3 – CD34 -; HSC), en sällsynt från 0,2 till 0,5% cellpopulationen i benmärgen. Denna experimentella proprotokoll kan vara bra att göra ultrastrukturstudier och erhålla kvantitativa resultat på många sällsynta men mycket viktiga populationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna metod gör det möjligt för TEM-analys på låga cellantal, med hjälp av Evans blå färgning och agaros bädda att lokalisera en liten cellpelleten under uttorkning, harts inbäddning och snittning processer. Viktigare, bibehåller den cellkluster tillsammans och bevarar cellultrastruktur, vilket är önskvärt att undersöka multipla celler för kvantifiering av data.
I TEM studier är en cellpellet innehållande miljontals celler ofta krävs för effektiv inbäddning i en agaros /…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).
Materials
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4°C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 gm in 50 ml of 0.1M Cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6 -Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For for details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
References
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).
- Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).
- Anderson, D. R. A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy. J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).
- Taupin, P. Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy. Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).
- Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy. J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).
- Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).
- Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations. J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).
- Hopwood, D. The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks. Histochemistry. 24, 50-64 (1970).
- Saini, R., et al. Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies. J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).
- Kumar, S., et al. The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation. J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).
