Ici, nous présentons un protocole pour préparer des échantillons avec un faible nombre de cellules pour l’analyse en microscopie électronique à transmission (MET).
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Article de méthode
Une approche alternative pour la préparation de l'échantillon avec une faible Nombre de cellules d'analyse TEM
Dans cet article
Résumé
Résumé
microscopie électronique à transmission (MET) fournit des détails sur l'organisation cellulaire et ultrastructure. Cependant, l'analyse TEM des populations de cellules rares, en particulier les cellules en suspension telles que des cellules souches hématopoïétiques (CSH), reste limitée en raison de l'exigence d'un grand nombre de cellules lors de la préparation de l'échantillon. Il y a quelques cytocentrifugation ou monocouche approches pour l'analyse TEM à partir d'échantillons rares, mais ces approches ne parviennent pas à obtenir des données quantitatives significatives du nombre limité de cellules. Ici, une approche alternative et novatrice pour la préparation d'échantillons dans les études TEM est décrit pour les populations de cellules rares qui permet une analyse quantitative.
Un certain nombre de cellules relativement faible, à savoir, 10.000 CSH, a été utilisé avec succès pour l' analyse TEM par rapport aux millions de cellules généralement utilisées pour les études de TEM. En particulier, Evans coloration au bleu a été réalisée après paraformaldéhyde-glutaraldéhyde (PFA-GA) fixation de visualiser le pel cellulaire minusculelaisser, ce qui a facilité l'intégration dans l'agarose. Clusters de nombreuses cellules ont été observées dans les sections ultra-minces. Les cellules ont une morphologie bien conservé, et les détails ultra-structure des mitochondries complexes et plusieurs Golgi étaient visibles. Ce protocole efficace, simple et reproductible, permet la préparation d'échantillons à partir d'un numéro de cellule faible et peut être utilisé pour l'analyse TEM qualitative et quantitative sur les populations de cellules rares à partir d'échantillons biologiques sont limitées.
Introduction
Détails ultra-structuraux et sous-organelles de cellules ont principalement été révélée par microscopie électronique à transmission (MET) des études de tissus ou des culots cellulaires 1,2. des morceaux solides de tissus peuvent être facilement utilisés pour des études de microscopie électronique. Cependant, TEM analyse 1,3 sur des cellules en suspension restent difficiles et nécessitent le nombre de cellules élevées, à savoir, des millions de cellules. De ce fait , les analyses structurelles des ultra-populations de cellules rares en suspension, par exemple, des cellules souches hématopoïétiques (CSH), ne sont pas facilement é....
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Protocole
Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le comité d'animaux dans les institutions à la recherche de la Fondation du Cincinnati Children. Pour cette étude, des cellules souches hématopoïétiques ont été isolées de la moelle osseuse de souris C57BL / 6 consanguines âgées de 2 - 4 mois. Cellule de tri en utilisant FACS après coloration des BM avec différents fabricants de surface , y compris Lineage, c-Kit, Sca-1, Flt3 et CD34 a été utilisé pour la purification de HSC basée sur Lin- Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 - gating stratégie comme protocole standard décrit avant 8.
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Résultats
Un protocole efficace et cohérent pour la préparation d'échantillons pour effectuer l'analyse TEM de faible nombre de cellules est décrit. Post-fixation coloration avec Evans bleu et le transfert de cellules dans un tube de 0,5 ml de microcentrifugation a aidé à visualiser le petit culot cellulaire 7. Osmification avec le tétraoxyde d'osmium dans de l'agarose a conduit à une détection aisée de la pastille de cellule sombre lors de la déshydratation et enrobage........
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Discussion
Cette méthode permet une analyse TEM sur un faible nombre de cellules, en utilisant Evans coloration bleu et agarose enrobage pour localiser une pastille de cellules minuscules lors de la déshydratation, enrobage de résine et les processus sectionner. Surtout, il maintient ensemble des agrégats de cellules et la cellule conserve l'ultra-structure, qui est souhaitable d'examiner de multiples cellules pour la quantification des données.
Dans les études TEM, une boulette cellulaire cont.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Nous remercions le Pathology Research Core pour son aide dans les études d’analyse au microscope électronique au Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. Le travail a été soutenu par le NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF ; R01 DK102890 au MDF).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Paraformaldéhyde 20 % Aqueux Soln | Microscopie électronique Sciences | 15713 | ATTENTION Toxique par inhalation, contact cutané. Portez des gants, utilisez une hotte. |
| Gluteraldéhyde 70 % Aqueux Soln | Microscopie électronique Sciences | 16350 | ATTENTION Toxique par inhalation, contact cutané. Portez des gants, utilisez une hotte. |
| Tampon de cacodyladate ; | Microscopie électronique Sciences | 12300 | Faire un tampon de cacodyladate de 0,1 M (pH 7,4) dans de l’eau distillée, conserver à 4 ° ;C. ATTENTION Irritant par inhalation ou contact avec la peau, porter des gants et travailler dans une hotte. |
| Evans Blue ; | Sigma | E-2129 | |
| Agarose à bas point de fusion ; | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Tétraoxyde d’osmium | Microscopie électronique Sciences | 19130 | 1 g dans 50 ml de tampon de cacodyladate 0,1 M pour faire 2 % OsO4 stock, ATTENTION Très toxique par inhalation ou contact cutané, oxydant fort, porter des vêtements de protection, protection oculaire, utiliser une hotte. |
| Kits d’intégration LX-112 (LADD® ;) | |||
| DDSA (anhydride dodécenylsuccinique) | LADD | 21340 | Mélanger 16 % de DDSA, 30 % de NMA ; 54 % de LX-112 puis ajouter 1,4 % de DMP-30 |
| NMA (anhydride méthylique nadique) | LADD | 21350 | |
| Résines époxy Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | ATTENTION Toxique par inhalation, contact avec la peau. Portez des gants, des vêtements de protection, utilisez une hotte. |
| DMP-30 (2,4,6-Tri(diméthylaminométhyl)phénol) | LADD | 21370 | |
| Citrate de plomb Reynolds (Teinture EM II) | Leica | CAUTION Toxique par inhalation, éviter tout contact avec la peau ou les yeux. | |
| Acétate d’uranyle (Coloration EM I) | Leica | 8072820 | ATTENTION Toxique par inhalation, éviter tout contact avec la peau ou les yeux. |
| l’ATCC | 30-2005 | d’Iscove | NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. Pour plus de détails, https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Moule à pointe pyramidale | Ted Pella | 10585 | |
| cylindres de montage | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome ; | (Leica EM UC7) | ||
| 200 grilles maillées (nikil) | Microscopie électronique Sciences | G-200 Ni | |
| Microscope électronique | Hitachi modèle H-7650 ; | ||
| Logiciel de moteur de capture d’images | AMT-600 ; | ||
| Boîtes de Pétri en plastique de 35 mm | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate ; | Microscopie électronique Sciences | 72588 | |
| Lames de rasoir Flacons | |||
| à scintillation en verre ; | Fisher scientific ; | 03-337-14 | |
| Lames de verre ; | |||
| Outil | |||
| Outil de boucle en métal ; |
Références
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).
- Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr Opin Neurobiol. 14, 591-5....
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Réimpressions et autorisations
