A Fluorescence Assay simple pour Quantification de Canine neutrophiles extracellulaires Piège sortie
Summary
pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont des réseaux d'ADN, les histones et les protéines de neutrophiles. Bien qu'une composante de la réponse immunitaire innée, TNE sont impliqués dans l'auto-immunité et de la thrombose. Ce protocole décrit une méthode simple pour l'isolement des cellules neutrophiles canins et la quantification de TNE en utilisant un dosage de fluorescence de microplaque.
Abstract
Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.
Introduction
Il y a plus de 70 millions de chiens de compagnie aux Etats – Unis seuls 1. En tant que membres de la famille d'une valeur, ces animaux reçoivent souvent la fine pointe des soins médicaux. De même , car ils partagent notre environnement, les chiens peuvent fournir des indications sur la pathogenèse et le traitement des maladies humaines 1. Cependant, si la traduction des découvertes pour la médecine humaine dans les traitements vétérinaires ou vice-versa, il est important de caractériser complètement les espèces des variations, même dans des systèmes hautement conservés, tels que la réponse immunitaire innée. Des exemples de différences entre la canine et le système immunitaire inné humain comprennent une forte expression de CD4 sur les neutrophiles de chien 2; l'absence d'un homologue fonctionnel du capteur de flagelline cytoplasmique chez les chiens IPAF 3 et l'expression d'un hybride caspase 4/1 chez les carnivores 4.
Pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont une composante relativement récemment découvert de l' immunité innée 5. TNE sont réseaus de l' ADN, des protéines nucléaires et granulaires libérés en réponse à un large éventail de stimuli inflammatoires ou infectieuses 6. Structures NET comme il a été démontré dans de nombreuses espèces , y compris les poulets, les poissons 7 8, 9 et mollusques acoelomates 10, mais il y a des variations d'espèces. Par exemple, les neutrophiles murins réagissent plus lentement aux stimuli NETosis que les neutrophiles humains, et forment les TNE moins diffuses 11. Il y a un grand nombre de preuves à partir de plusieurs espèces TNE piègent microbes, et plus controversée peut être directement impliqué dans tuer les agents pathogènes 12,13. Cependant, les composants NET augmentent également des dommages aux tissus, favorisent la thrombose et d' agir comme autoantigènes 14,15. L'équilibre entre les effets bénéfiques et néfastes de TNE peuvent varier entre les différentes maladies et d'espèces différentes, ce qui suggère qu'il est important d'étudier les TNE tant dans les espèces et l'état de l'intérêt.
ici, nousdécrire un protocole simple pour induire et mesurer la libération de TNE par les neutrophiles canins. Cette méthode est similaire à celles utilisées pour isoler les 16 neutrophiles et d' induire NETosis chez d' autres espèces, mais les conditions telles que la concentration de l' agoniste et le temps d'incubation ont été optimisés pour les neutrophiles canins. Un essai de libération similaire d'ADN de quantification NET a également été décrit dans d' autres espèces , mais la méthode présentée ici est également optimisé pour les chiens 8,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le test ADN de libération présentée est un test facilement quantifiables pour l'ADN extracellulaire. La méthode a été adaptée à partir des techniques similaires utilisées pour évaluer la formation NET dans d' autres espèces, mais des vitesses de centrifugation, des concentrations agonistes et des temps d'incubation ont été modifiés afin d' optimiser le procédé pour une utilisation avec des neutrophiles canins 8,17,18. Des ajustements similaires pourraient être faits pour adapt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge Drs James Roth, William Nauseef and Kayoko Kimura and Mr Tom Skadow for assistance with development of the canine neutrophil protocols. RDG is supported by a Wellcome Trust Fellowship ref: WT093767MA.
Materials
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
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