कुत्ते न्युट्रोफिल कोशिकी जाल रिलीज की मात्रा का ठहराव के लिए एक सरल प्रतिदीप्ति परख
Summary
न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (जाल) डीएनए, histones और न्युट्रोफिल प्रोटीन का नेटवर्क रहे हैं। सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के एक घटक हालांकि, जाल औतोइम्मुिनित थ्रोम्बोसिस में फंसा रहे हैं। इस प्रोटोकॉल कुत्ते न्युट्रोफिल अलगाव और एक microplate प्रतिदीप्ति परख का उपयोग नेट की मात्रा का ठहराव के लिए एक सरल विधि का वर्णन है।
Abstract
Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.
Introduction
वहाँ अकेले 1 संयुक्त राज्य अमेरिका में 70 लाख से अधिक पालतू कुत्ते हैं। मूल्यवान परिवार के सदस्यों के रूप में, इन जानवरों अक्सर बढ़त चिकित्सा देखभाल काटने प्राप्त करते हैं। समान रूप से, क्योंकि वे हमारे पर्यावरण का हिस्सा है, कुत्तों रोगजनन और मानव रोग 1 के उपचार में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। हालांकि, पशु चिकित्सा उपचार या ठीक इसके विपरीत में मानव चिकित्सा के क्षेत्र में खोजों के अनुवाद चाहे, यह महत्वपूर्ण है अच्छी तरह से इस तरह के सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में प्रजातियों भी अत्यधिक संरक्षित सिस्टम में बदलाव को चिह्नित करने के लिए है। कुत्ते और मानव सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच मतभेद के उदाहरण कुत्ते न्यूट्रोफिल 2 पर उच्च अभिव्यक्ति सीडी 4 शामिल हैं; कुत्तों 3 में cytoplasmic flagellin सेंसर IPAF के एक कार्यात्मक Homolog के अभाव और मांसाहारी 4 में एक कस्पासे 1/4 संकर की अभिव्यक्ति।
न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (जाल) जन्मजात प्रतिरक्षा में 5 की एक अपेक्षाकृत हाल ही में पता चला घटक हैं। जाल नेटवर्क रहे हैंडीएनए, परमाणु और बारीक भड़काऊ या संक्रामक उत्तेजनाओं 6 की एक विस्तृत श्रृंखला के जवाब में जारी प्रोटीन के एस। नेट संरचनाओं की तरह मुर्गियों 7, 8 मछली, घोंघे 9 और 10 acoelomates सहित कई प्रजातियों भर में प्रदर्शन किया गया है, लेकिन वहाँ प्रजातियों बदलाव कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, murine न्यूट्रोफिल मानव न्यूट्रोफिल से NETosis उत्तेजनाओं को अधिक धीरे धीरे जवाब है, और कम फैलाना जाल 11 के रूप में। वहाँ कई प्रजातियों कि जाल रोगाणुओं फंसाने, और अधिक विवादास्पद सीधे रोगजनकों 12,13 हत्या में शामिल किया जा सकता से सबूत की एक बड़ी संस्था है। हालांकि, नेट घटक भी, ऊतकों को नुकसान बढ़ाने घनास्त्रता और अधिनियम को बढ़ावा देने के रूप में autoantigens 14,15। नेट की लाभकारी और हानिकारक प्रभाव के बीच संतुलन विभिन्न रोगों और विभिन्न प्रजातियों के बीच भिन्न हो सकते हैं, सुझाव है कि यह दोनों प्रजातियों और ब्याज की हालत में नेट की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है।
यहाँ हमउत्प्रेरण और कुत्ते न्यूट्रोफिल द्वारा नेट की रिहाई को मापने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन। इस विधि न्यूट्रोफिल 16 अलग और अन्य प्रजातियों में NETosis प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के लिए इसी तरह की है, लेकिन इस तरह के एगोनिस्ट एकाग्रता और ऊष्मायन समय के रूप में की स्थिति कुत्ते न्यूट्रोफिल के लिए अनुकूलित किया गया है। इसी तरह की एक नेट मात्रा का ठहराव डीएनए रिहाई परख भी अन्य प्रजातियों में वर्णित किया गया है, लेकिन यहां प्रस्तुत विधि भी कुत्तों 8,17,18 के लिए अनुकूलित है।
Protocol
Representative Results
Discussion
डीएनए रिहाई प्रस्तुत परख कोशिकी डीएनए के लिए एक आसानी से मात्रात्मक परख है। विधि अन्य प्रजातियों में नेट गठन का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है इसी तरह की तकनीक से अनुकूलित किया गया था, लेकिन centrifugation…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge Drs James Roth, William Nauseef and Kayoko Kimura and Mr Tom Skadow for assistance with development of the canine neutrophil protocols. RDG is supported by a Wellcome Trust Fellowship ref: WT093767MA.
Materials
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
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