Köpek Nötrofil Ekstrasellüler Trap Release Niceleme için Basit Floresan Testi
Summary
Nötrofil dışı tuzaklar (NET) DNA, histon ve nötrofil proteinlerin ağlardır. Doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin bir bileşeni olmasına rağmen, ağ otoimmün ve tromboz implike edilmiştir. Bu protokol, köpek nötrofil izolasyon ve bir mikroplaka flüoresans deneyi kullanılarak NET'ler ölçümü için basit bir yöntem tarif eder.
Abstract
Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.
Introduction
70 milyon evcil köpekler 1 yalnız ABD'de bulunmaktadır. Değerli aile üyeleri olarak, bu hayvanlar genellikle kenar tıbbi bakım kesim alırsınız. Onlar bizim ortamı paylaşmak Eşit, çünkü köpekler insan hastalıkları 1 patogenezinde ve tedavisinde içgörü sağlayabilir. Ancak, veterinerlik uygulamaları ya da tam tersi olarak insan tıbbında keşifler çeviri olup, iyice gibi doğuştan gelen bağışıklık yanıtı bile yüksek ölçüde korunmuş sistemlerde türleri varyasyonları karakterize etmek için önemlidir. Köpek ve insan doğuştan gelen bağışıklık sistemi arasındaki farklar örnekleri köpek nötrofil 2 yüksek ifade CD4 arasında; Köpeklerde 3 sitoplazmik flagellin sensörü IPAF fonksiyonel homolog olmaması ve etobur 4 bir kaspaz 1/4 melez ifadesi.
Nötrofil dışı tuzaklar (NET) doğuştan gelen bağışıklık 5 nispeten yeni keşfedilen bileşenidir. NET'ler ağı vardırenflamatuar veya enfeksiyöz uyaranlara 6 geniş bir tepki olarak serbest DNA çekirdek ve granül proteinleri s. NET benzeri yapılar tavuk 7, balık 8, yumuşakçalar 9 ve 10 acoelomates dahil olmak üzere birçok türler arasında gösterilmiştir, ancak tür farklılıklar vardır. Örneğin, kemirgen nötrofiller, insan nötrofillerinden daha NETosis uyaranlara yanıt daha yavaş ve daha az yaygın NET'leri 11 oluşturur. NET'ler doğrudan patojenleri 12,13 öldürme dahil olabilir daha tartışmalı mikropları yakalamak ve çoklu türlerden kanıt büyük bir gövde var. Ancak, NET bileşenleri de, doku hasarına geliştirmek 14,15 Otoantijenler olarak trombozu ve hareket teşvik. NET'ler yararlı ve zararlı etkilerini arasındaki denge tür ve ilgi durumda her iki NET'leri araştırılması önemlidir öne farklı hastalıklar ve farklı türler arasında değişebilir.
buradauyaran ve köpek nötrofiller tarafından NET'ler salınımını ölçmek için basit bir protokol açıklar. Bu yöntem, nötrofil 16 izole etmek ve diğer türlerde NETosis uyarılması için kullanılanlara benzer, ancak bu tür agonist konsantrasyonunun ve kuluçkalama süresi gibi koşullar, Kanin nötrofiller için optimize edilmiştir. Benzer bir .NET miktar DNA salma tahlili diğer türlerde de tarif edilmiştir, ancak burada sunulan yöntem köpeklerde 8,17,18 için optimize edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
sunulan DNA salınım testi dışı DNA için bir kolaylıkla ölçülebilir testtir. Yöntem, diğer türlerdeki NET oluşumunu değerlendirmek için kullanılan benzer teknikler uyarlanmıştır ancak santrifüj hızları agonist konsantrasyonları ve inkübasyon süreleri köpek nötrofil 8,17,18 ile kullanım için bir yöntem optimize etmek için değiştirildi. Benzer düzenlemeler, diğer türler için bir yöntem adapte yapılabilir. deney gibi akış sitometrisi veya görüntü analizi gibi NETosis ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge Drs James Roth, William Nauseef and Kayoko Kimura and Mr Tom Skadow for assistance with development of the canine neutrophil protocols. RDG is supported by a Wellcome Trust Fellowship ref: WT093767MA.
Materials
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
- Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673 (2015).
- Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).
- Eckhart, L., et al. Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog. Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).
- Eckhart, L., et al. Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire. Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).
- Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas. J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).
- Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon. Nat Commun. 5, 4627 (2014).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore?. Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).
- Martinod, K., Wagner, D. D. Thrombosis: tangled up in NETs. Blood. 123 (18), 2768-2776 (2014).
- Pratesi, F., et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps. Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).
- Gray, R. D., et al. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps. J Inflamm (Lond). 10 (1), 12 (2013).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- McCracken, J. M., Allen, L. A. Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease. J Cell Death. 7, 15-23 (2014).
