A Simple Fluorescence Assay voor het kwantificeren van Canine neutrofielen extracellulaire inklembeveiliging
Summary
Neutrofielen extracellulaire vallen (NET's) zijn netwerken van DNA, histonen en neutrofielen eiwitten. Hoewel een deel van de aangeboren immuunrespons zijn NET betrokken bij autoimmuniteit en trombose. Dit protocol beschrijft een eenvoudige werkwijze voor honden neutrofielen isolatie en kwantificering van netten met een microplaat fluorescentie assay.
Abstract
Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.
Introduction
Er zijn meer dan 70 miljoen honden in de Verenigde Staten alleen al 1. Als gewaardeerde familieleden, deze dieren krijgen vaak cutting edge medische zorg. Net zo omdat ze onze omgeving delen, kunnen honden inzichten in de pathogenese en behandeling van ziekten bij de mens 1 te verstrekken. Echter, of het vertalen ontdekkingen in de menselijke geneeskunde in diergeneeskundige behandeling of vice versa, is het belangrijk om grondig te karakteriseren soorten variaties ook in sterk geconserveerde systemen zoals de aangeboren immuunrespons. Voorbeelden van verschillen tussen de hond en de menselijke aangeboren immuunsysteem onder hoge expressie CD4 bij de hond neutrofielen 2; het ontbreken van een functioneel homoloog van de cytoplasmatische flagelline sensor IPAF bij honden 3 en de expressie van caspase 1/4 hybride carnivoren 4.
Neutrofielen extracellulaire vallen (NET's) zijn een relatief recent ontdekte component van aangeboren immuniteit 5. NET zijn netwerks van DNA, nucleaire en granulaire eiwitten die in reactie op een groot aantal inflammatoire of infectieuze stimuli 6. NET-structuren aangetoond in vele soorten, waaronder kippen 7, vis 8, 9 en weekdieren acoelomates 10, maar er zijn soorten variaties. Bijvoorbeeld, muizen neutrofielen reageren langzamer op NETosis stimuli dan menselijke neutrofielen, en vormen minder diffuus NET 11. Er is een grote hoeveelheid bewijs uit meerdere soorten die netten vangen microben, en nog veel meer controversieel kan rechtstreeks worden betrokken bij het doden van ziekteverwekkers 12,13. Echter, NET componenten ook verbetering van weefselbeschadiging, het bevorderen van trombose en fungeren als autoantigenen 14,15. Het evenwicht tussen de positieve en schadelijke effecten van netten kunnen variëren tussen de verschillende ziekten en verschillende soorten aangeeft dat belangrijk NET zowel de soort en toestand van belang te onderzoeken.
Hier Wijbeschrijven een eenvoudig protocol voor het induceren en het meten van het vrijkomen van NET door honden neutrofielen. Deze methode is vergelijkbaar met die toegepast om neutrofielen 16 isoleren en induceren NETosis in andere soorten, maar omstandigheden zoals agonist concentratie en incubatietijd zijn geoptimaliseerd voor honden neutrofielen. Eenzelfde NET kwantificatie DNA afgifte test is ook beschreven in andere soorten, maar de hier gepresenteerde methode is ook geoptimaliseerd voor honden 8,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
De DNA-afgifte assay gepresenteerd een gemakkelijk meetbare test voor extracellulair DNA. De methode werd aangepast van soortgelijke technieken gebruikt om netvorming beoordelen andere soorten, maar centrifugatie snelheden agonist concentraties en incubatietijden zijn gewijzigd volgens de methode te optimaliseren met canine neutrofielen 8,17,18. Soortgelijke aanpassingen kunnen worden aangebracht in de werkwijze voor andere soorten passen. De test is eenvoudig en goedkoop in vergelijking met andere werkwijzen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge Drs James Roth, William Nauseef and Kayoko Kimura and Mr Tom Skadow for assistance with development of the canine neutrophil protocols. RDG is supported by a Wellcome Trust Fellowship ref: WT093767MA.
Materials
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
References
- Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673 (2015).
- Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).
- Eckhart, L., et al. Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog. Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).
- Eckhart, L., et al. Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire. Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).
- Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas. J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).
- Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon. Nat Commun. 5, 4627 (2014).
- Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).
- Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore?. Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).
- Martinod, K., Wagner, D. D. Thrombosis: tangled up in NETs. Blood. 123 (18), 2768-2776 (2014).
- Pratesi, F., et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps. Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).
- Gray, R. D., et al. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps. J Inflamm (Lond). 10 (1), 12 (2013).
- Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).
- McCracken, J. M., Allen, L. A. Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease. J Cell Death. 7, 15-23 (2014).
