Простое и эффективное производство и очистка мыши миелина олигодендроцитов гликопротеина для экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита исследований
Summary
We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.
Abstract
Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.
Introduction
МС представляет собой человека заболевание, характеризующееся хроническим воспалением и нейродегенеративные ЦНС, которые, как полагают, будут обусловлены аутоиммунного ответа, направленного в сторону миелина. Потеря миелина и аксонов с течением времени приводит к постепенному снижению когнитивной и двигательной функции 1. "Экспериментальная аутоиммунный энцефаломиелит" является общим термином для животных моделях аутоиммунных заболеваний, направленной на ЦНС миелина. Как человека MS, EAE , как правило , характеризуется иммунной клеточной инфильтрацией ЦНС и, в некоторых случаях, демиелинизация 2. Тем не менее, степень, в которой любая данная модель ЕАЕ напоминает человеческую MS частично зависит от вида или штамма, используемых и по сложности нижележащей анти-миелинового аутоиммунного ответа.
Анти-миелина аутоиммунные может быть экспериментально индуцированных несколькими способами, но наиболее распространенный метод, используемый сегодня для иммунизации мышей с коротким пептидом аминокислот, имитирующих иммунодоминантный CD4 <sвверх> + Т – клеточный эпитоп белка миелина. Это представляет собой минимальное требование, чтобы вызвать патологическую реакцию. Пожалуй, наиболее распространенным из них является пептидным 21 амино- полученный из миелин олигодендроцитов гликопротеин (MOG 35-55), который используется для индукции EAE в C57BL / 6 мышей 3. Тем не менее, для некоторых экспериментальных целей желательно или даже необходимо вакцинировать с более крупными белковых антигенов и в самом деле есть несколько преимуществ этого более короткого иммунизации пептида. Во-первых, из-за ограничения MHC, короткие пептиды, как правило, эффективны лишь в очень ограниченном диапазоне напряжений, в то время как более крупные белковые антигены, представляющие либо весь белок или конкретный домен может быть обработан как правило, для представления в нескольких штаммов инбредных мышей или даже у разных видов 4. Во-вторых, больший белковый антиген, способный индуцировать более сложный иммунный ответ, включающий более типов лимфоцитов в распознавании антигена, а не limitinг распознавание антигена к CD4 + Т – клеток. Например, В-клетки через их B клеточного рецептора (BCR) взаимодействуют непосредственно с целым, а не обработанного белка. Мы и другие показали , что В – клетки активируются MOG 35-55 иммунизации не признают MOG белок 5. Так как В – клетки были недавно продемонстрированы играть патогенную роль в человеческом МС 6, модели EAE , которые включают В – клеток в аутоиммунной патологии приобретают все большее значение.
Несмотря на преимущества использования более крупных белковых антигенов для индукции EAE, остаются несколько коммерчески доступных источников для таких белков. В самом деле, в то время как короткие пептиды , такие как MOG 35-55 , могут быть синтезированы очень быстро и при относительно низкой стоимости, коммерческие варианты белка MOG ограничены , и стоимость значительно больше , чтобы купить. Тем не менее, существует несколько векторов экспрессии , доступных для исследовательских групп для создания MOG внеклеточный домен (MOG 1-125) сами. Howeveг, все системы экспрессии , которые мы определили в литературе, основаны на старых технологиях , которые с тех пор были заменены на более эффективные системы экспрессии 7. Кроме того, большинство из них основаны на крысиной или человеческой MOG 8. Для некоторых исследований аутоиммунные у мышей, антиген на основании мыши MOG аутоантигенов является предпочтительным. И, наконец, все MOG на основе белков , которые мы определили, либо коммерческие или как векторы экспрессии, представляют собой слитые белки , содержащие дополнительные аминокислоты к основанию MOG 1-125. Они включают в себя тег для очистки и, как правило, другие последовательности, а также, многие из которых с функцией мы не смогли определить.
Для устранения этих ограничений, мы получили новый слитый белок на основе мыши MOG внеклеточного домена , слитого с меткой , содержащей тиоредоксин для борьбы с известной нерастворимость MOG белка 5. Последовательность тэгов также содержит последовательность 6xHis для очистки и протеазы TEV НКУсайт Avage, что позволяет полного удаления всех последовательностей тегов, если это необходимо. Это единственный метод , который мы отдаем себе отчет , чтобы генерировать чистый MOG 1-125 белка. Для облегчения производства больших количеств белка, последовательность МОГ 1-125 была оптимизированными в отношении кодонов для экспрессии в бактериях и тег слитый белок МОГ был вставлен в систему экспрессии , пет-32. Здесь мы опишем подробно протокол для получения и очистки MOG тегов белка, и чистый MOG 1-125, используя неспециализированной оборудование , доступное для большинства иммунологических лабораторий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали протокол для производства MOG белка тегов и как генерировать чистую MOG 1-125 из белка MOG тега. Этот протокол основан как на стандартных методах His-меткой на основе очистки белков, а также ранее описанного протокола для генерации старше MOG на основе белка 1…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ is the recipient of the Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Studentship Award.
Materials
| BL21 E.coli– pet32-MOGtag | Kerfoot lab | These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request. | |
| LB broth miller | Bioshop | LBL407.1 | |
| Ampicillin | bio basic | AB0028 | Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C. |
| IPTG | Bioshop | IPT002.5 | Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C. |
| Chicken-egg lysozyme | Bioshop | LYS702.10 | Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C. |
| Triton-X100 | Sigma | T-8532 | |
| Phosphate buffered saline | life technologies | 20012-027 | Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient. |
| Sodium chloride | Bioshop | SOD004.1 | |
| Tris-HCl | Bioshop | TRS002.1 | |
| Imidazole | Bioshop | IMD508.100 | |
| Guanidine-HCl | Sigma | G3272 | The quality must be greater than 98% purity. |
| 0.5M EDTA | bioshop | EDT111.500 | |
| Nickel (II) sulfate | Bioshop | NIC700.500 | |
| His bind resin | EMD Millipore | 69670-3 | Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C |
| Anhydrous ethanol | Commercial Alcohols | P016EAAN | Dilute with water as needed. |
| Glacial acetic acid | Bioshop | ACE222.1 | |
| Sodium acetate trihydrate | Bioshop | SAA305.500 | |
| bovine serum albumin standard | bio-rad | 500-0206 | |
| Bio-rad protein assay dye reagent concentrate | bio-rad | 500-0006 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate | Fisher scientific | BP120-500 | |
| Tris-base | Bioshop | TRS001.1 | |
| 7000 MW Snakeskin dialysis tubing | Thermoscientific | 68700 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ml | This reagent should not be handled outside of a fume hood. |
| AcTEV protease | lifetechnologies | 12575-015 | Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17 |
| Polyethyleneglycol 3350 | Bioshop | PEG335.1 | |
| polyethyleneglycol 8000 | Bioshop | PEG800.1 | |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate | ebioscience | 44-2404-21 | |
| Sonicator | Fisher scientific | FB-120-110 | |
| Eon microplate spectrometer | Biotek | 11-120-611 | This equipment uses the Gen5 data analysis software. |
| Gen5 data analysis software | BioTek | ||
| sodium dodecyl sulphate | Bioshop | SDS001 | |
| bromophenol blue | Bioshop | BRO777 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001 | |
| Protein desalting columns | Thermoscientific | 89849 | |
| Glycine | Bioshop | GLN001 | |
| precast 12% polyacrylamide gel | bio-rad | 456-1045 | |
| Rapid stain reagent | EMD Millipore | 553215 | |
| Gel dock EZ imager | bio-rad | 1708270 | |
| White Light Sample Tray | bio-rad | 1708272 | Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains |
| Protein ladder | bio-rad | 1610375 |
References
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
- Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22 (2014).
- Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
- Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).
- Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).
- Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. , (2016).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2016).
- Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).
- Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470 (2015).
- LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
- Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
- Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).
- Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6 (1), e16136 (2011).
- Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).
- Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).
- Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).
- Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).
