प्रोटीन की गुणवत्ता नियंत्रण प्रणाली का अध्ययन<em> डी। discoideum</em> तापमान नियंत्रित लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग
Summary
The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.
Abstract
The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system.
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.
Introduction
Dictyostelium discoideum एकान्त मिट्टी के रहने वाले अमीबा कि बैक्टीरिया और अन्य सूक्ष्मजीवों, जो phagocytosis द्वारा लिया जाता है पर भोजन प्राप्त करते हैं। यह एक अद्वितीय और उल्लेखनीय जीवन चक्र है कि इसकी खोज के बाद से 1 अनुसंधान का एक प्रमुख क्षेत्र रहा है है। बहुकोशिकीय विकास 2 और 3 chemotaxis के आणविक आधार के शुरू में ब्याज जल्द ही सेल गतिशीलता, सेल polarity, सहज प्रतिरक्षा पर ध्यान केंद्रित अध्ययन के द्वारा पूरित था। इसके अलावा, डी discoideum जैव चिकित्सा अनुसंधान 4,5 के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में पेश किया गया था।
हाल ही में, हम डी स्थापित discoideum प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण (PQC) प्रणाली 6.7 अध्ययन करने के लिए एक नई प्रणाली के रूप में। इसके proteome एकत्रीकरण की आशंका प्रिओन की तरह प्रोटीन है, जो प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण 8 के लिए एक चुनौती बन गया है में समृद्ध है। कि क्या जांच करने के लिए डी discoideum इसकी अत्यधिक एजी नियंत्रित करने के लिए विशेष आणविक तंत्र विकसित किया गया हैgregation-प्रवण proteome, हम दोनों सामान्य विकास शर्तों के तहत और तनाव के दौरान एकत्रीकरण की आशंका मार्कर प्रोटीन के व्यवहार का अध्ययन किया। जैसे गर्मी तनाव के रूप में तनाव की स्थिति, प्रोटीन misfolding 9 की दर में वृद्धि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए, हम एक ऐसी प्रणाली है, जहां हम तापमान में परिवर्तन के लिए प्रेरित और एक साथ मार्कर प्रोटीन के व्यवहार का पालन कर सकता है की मांग की। इस प्रयोजन के लिए, हम Peltier नियंत्रित हीटिंग एक थर्मल चरण डालने (शीतलन कक्ष) का उपयोग कर के साथ लाइव सेल इमेजिंग संयुक्त। इस विधि हमें एक निरंतर और एक समान तापमान बनाए रखने के साथ-साथ एक तेजी से, अभी तक सटीक तापमान परिवर्तन के लिए प्रेरित करने की अनुमति दी।
लाइव सेल इमेजिंग डी में जैविक प्रक्रियाओं की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है discoideum। हालांकि, इस दृष्टिकोण के दो प्रमुख सीमाओं चेहरे। सबसे पहले, कोशिकाओं को एक उच्च गतिशीलता प्रदर्शित करने और देखने के क्षेत्र से बाहर की ओर पलायन करते हैं, इस प्रकार व्यक्ति की कोशिकाओं की ट्रैकिंग अक्सर एक बड़े क्षेत्र की इमेजिंग की आवश्यकता है। सेल गतिशीलता कर सकते हैंआगर ओवरले 10 तक कम किया जा सकता है, हालांकि, इन स्थितियों नहीं दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए उपयुक्त व्यवहार्यता में गिरावट के कारण हैं। दूसरा, डी discoideum कोशिकाओं तस्वीर विषाक्तता, जो सेल गोलाई और mitotic गिरफ्तारी के 11 में परिणाम के लिए एक विशेष रूप से उच्च संवेदनशीलता दिखा। पिछले प्रोटोकॉल एक कट्टरपंथी मेहतर और जोखिम बार 12 की कमी के रूप में एस्कॉर्बेट के अलावा द्वारा इस मुद्दे को संबोधित किया। बाद के महत्वपूर्ण यदि ब्याज की प्रोटीन कम स्तर पर व्यक्त की और एक कमजोर प्रतिदीप्ति संकेत से पता चलता है हो सकता है। लेखकों को भी या तो एक वातानुकूलित कमरे में इमेजिंग द्वारा या तापमान नियंत्रित ऊष्मायन बक्से, जो उद्देश्य और माइक्रोस्कोप चरण 12 को कवर का उपयोग करके 21 डिग्री सेल्सियस के एक निरंतर तापमान प्रदान करने के लिए सुझाव देते हैं।
यहाँ, हम एक शीतलन कक्ष 23 डिग्री सेल्सियस पर सेट का उपयोग करके सुधार तापमान नियंत्रण के साथ एक विधि का वर्णन। हमारे सेट-अप इमेजिंग के दौरान काफी तस्वीर विषाक्तता के लिए प्रतिरोध को बढ़ाता है। यहउच्च जोखिम बार और उच्च उत्तेजना प्रकाश तीव्रता के उपयोग की अनुमति देता है। इस के रूप में समय अंतराल ध्यान से imaged पदों की संख्या और जोखिम का इस्तेमाल किया समय के खिलाफ संतुलित करने की आवश्यकता, समय चूक इमेजिंग के दौरान विशेष महत्व का है। संभावना imaged पदों की संख्या बढ़ाने के लिए भी एक व्यापक इमेजिंग क्षेत्र के कवरेज की अनुमति देता है और समय की एक लंबी अवधि में व्यक्ति की कोशिकाओं की ट्रैकिंग की सुविधा।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल गर्मी प्रेरित तनाव के जवाब में ब्याज की एक विशेष प्रोटीन के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 30 डिग्री सेल्सियस के तापमान में वृद्धि गर्मी तनाव की प्रतिक्रिया को गति प्रदान करने के लिए और सूचित किया गया है डी की व्यवहार्यता इन परिस्थितियों discoideum स्पष्ट रूप से कम है।
संशोधनों
प्रोटोकॉल एक ही तनाव की स्थिति के तहत विभिन्न प्रोटीन के व्यवहार की तुलना करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस के लिए, एक ही फ्लोरोसेंट टैग के साथ अलग प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं में इस तरह के चार कक्ष व्यंजन (धारा 1.3.1) के रूप में, बहु अच्छी तरह से बर्तन में स्थानांतरित कर रहे हैं। प्रोटोकॉल भी सह व्यक्त जैसे GFP या आरएफपी के रूप में अलग मार्कर, साथ प्रोटीन कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है। इस प्रोटीन की गुणवत्ता नियंत्रण (PQC) प्रणाली के विभिन्न घटकों के व्यवहार पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया, उदाहरण के लिए हो सकता है। GFP टैग एकत्रीकरण मार्कर और अलग आरएफपी टैग PCQ घटकों व्यक्त कोशिकाओं बहु अच्छी तरह से उपयोग करते हुए देखा जा सकता हैइमेजिंग के लिए dished। यह एक ही तनाव की स्थिति (तापमान वृद्धि / कमी, तापमान में वृद्धि / कमी की अवधि की गति) सुनिश्चित करता है और तुलनात्मक अध्ययन के लिए अनुमति देता है।
इसके अलावा, प्रोटोकॉल गर्मी तनाव की प्रतिक्रिया पर PQC प्रणाली के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। घटकों की गतिविधियों को इस तरह के नाक आउट या overexpression के रूप में आनुवंशिक उपकरण का उपयोग कर अभिव्यक्ति के स्तर बदलकर या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विशिष्ट अवरोधकों 6 का उपयोग करके संग्राहक जा सकता है। एंटीबॉडी मध्यम विकास के लिए MG132 (100 माइक्रोन) के या lactacystin (10 माइक्रोन) के जोड़ने से हिचकते जा सकता है। निगरानी HSP90 geldanamycin (6 माइक्रोन) या radicicol (10 माइक्रोन) का उपयोग कर हिचकते जा सकता है। निगरानी Hsp70, देखें-155088 के साथ हिचकते जा सकता है, हालांकि हम अब तक हमारे प्रयोगात्मक सेटिंग्स में अवरोध की प्रभावकारिता पुष्टि नहीं कर सका। Inhibitors इमेजिंग से पहले एक दिन में जोड़ा जाना चाहिए और कोशिकाओं 14 घंटे के लिए incubated हैं।
Criti प्रोटोकॉल के भीतर कैलोरी कदम
गर्मी प्रेरित गड़बड़ी के आकलन के लिए महत्वपूर्ण कदम कोशिकाओं इमेजिंग प्रयोग करने से पहले की स्थिति है। खमीर में अध्ययन से पता चला कोशिकाओं स्थिर चरण 13 के दौरान पर्यावरण तनाव की एक किस्म के लिए प्रतिरोध हासिल है। हम यह भी लागू गर्मी तनाव यदि डी करने के लिए कम से कम जवाबदेही मनाया discoideum कोशिकाओं इमेजिंग के लिए पहले स्थिर चरण में पहुंच गया था। इसलिए, एक निरंतर सेल नंबर को बनाए रखने <5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल महत्वपूर्ण है।
इसके अलावा, उच्च सेल नंबर डी की वनस्पति चक्र से संक्रमण पैदा कर सकते हैं विकास चक्र को discoideum, इस प्रकार भुखमरी रास्ते, जो एक अलग प्रतिक्रिया को जन्म दे सकता है तनाव गर्म करने के लिए ट्रिगर। उच्च सेल नंबर गर्मी तनाव, स्ट्रीमिंग के बाद वसूली चरण में पहुँच रहे हैं और कुल कोशिकाओं डेटा विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के रूप में कोशिकाओं ध्यान से बाहर ले जाते हैं (चित्रा 4 देखें)।
सामग्री "> तकनीक की सीमाध्यान की हानि प्रोटोकॉल की टोंटी है। तापमान परिवर्तन के दौरान, फोकल हवाई जहाज़ में काफी बदलाव कर सकते हैं, जो तुरंत तापमान बदलने के बाद एक समय अवधि में मैनुअल refocusing की आवश्यकता है। ध्यान में कूद कभी कभी भी चरम सॉफ्टवेयर ऑटोफोकस द्वारा दूर किया जा करने के लिए हो सकता है, समय बिंदुओं के बीच के समय में उच्च है, खासकर अगर। हालांकि, अगर इस्तेमाल माइक्रोस्कोप एक हार्डवेयर ऑटोफोकस के साथ सुसज्जित है, इस अड़चन धोखा दिया जा सकता है।
मौजूदा तरीकों के लिए सम्मान के साथ तकनीक का महत्व
इस तरह वातानुकूलित कमरे, तापमान नियंत्रित ऊष्मायन के उद्देश्यों और खुर्दबीन मंच या तापमान नियंत्रित चरणों और उद्देश्य कॉलर को कवर बक्से के उपयोग के रूप में मौजूदा setups के साथ तुलना में, एक शीतलन कक्ष के उपयोग के परिवेश का एक और अधिक सटीक नियंत्रण प्रदान करता है तापमान। शीतलन कक्ष में Peltier-तत्व एक निरंतर और एक समान मंदिर बनाए रख सकते हैंप्रयोगात्मक सेटअप भर perature। शास्त्रीय setups में, स्थानीय तापमान मतभेद अलग अवलोकन परिणामों को जन्म दे सकता है। इसके अलावा, यह जल्दी और तेजी से तापमान में परिवर्तन के लिए प्रेरित जवाब कर सकते हैं, जबकि शास्त्रीय setups प्रेरित तापमान में परिवर्तन करने के लिए बहुत धीरे-धीरे अनुकूल है, विशेष रूप से तापमान को कम। शीतलन कक्ष में Peltier तत्व भी एक व्यापक तापमान रेंज (15-40 डिग्री सेल्सियस) शास्त्रीय setups से है, जिसके साथ इस तरह के 15 डिग्री सेल्सियस या 40 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच गया के रूप में तापमान बहुत मुश्किल है कवर कर सकते हैं।
Dictyostelium discoideum विशेष रूप से फोटो विषाक्तता के प्रति संवेदनशील है। पिछले अध्ययनों मेहतर के रूप में इस्तेमाल किया एस्कॉर्बेट तस्वीर विषाक्तता को कम करने के लिए। हालांकि, लंबी अवधि इमेजिंग अतिरिक्त पूरकता की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, एस्कॉर्बेट के उपयोग के अध्ययन जहां ब्याज की व्यवस्था एंटीऑक्सीडेंट पूरक से प्रभावित नहीं है तक सीमित है। हम जानते हैं कि तापमान नियंत्रित इमेजिंग के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता appr का प्रस्तावoach तस्वीर विषाक्तता को कम करने के लिए और आगे की विषाक्तता को कम करने के एस्कॉर्बेट के अलावा के साथ जोड़ा जा सकता है।
Phototoxic प्रभाव एक शीतलन कक्ष का उपयोग कर 23 डिग्री सेल्सियस के एक निरंतर और एक समान तापमान प्रदान करके कम से कम किया जा सकता है। तापमान नियंत्रण का उपयोग कर imaged कोशिकाओं तस्वीर विषाक्तता, इस तरह के सेल गोलाई के कम लक्षण, एक लंबे समय अवधि के लिए दिखा। यह भी उच्च तीव्रता, छोटे समय के अंतराल या दृश्य (FOVs) के और अधिक क्षेत्रों के साथ इमेजिंग की अनुमति देता है।
सामान्य उपयोग
उच्च तापमान पर गर्मी तनाव एक अलग गर्मी तनाव की प्रतिक्रिया 14 को गति प्रदान करने के लिए दिखाया गया है। इसलिए, 34 डिग्री सेल्सियस या 37 डिग्री सेल्सियस तक तापमान में वृद्धि के लिए एक अलग प्रतिक्रिया उत्पन्न हो सकता है। लागू किया तापमान तनाव के अलावा, एक विशेष तनाव की स्थिति की अवधि तत्काल प्रतिक्रिया या लंबी अवधि के अनुकूलन तनाव गर्म करने के लिए अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।
सामान्य तौर पर, वर्णित प्रोटोकॉल हो सकता हैआवेदनों की एक विस्तृत सेट करने के लिए विस्तार किया। क्योंकि सटीक तापमान नियंत्रण काफी तस्वीर विषैले प्रभाव को कम करता है, प्रोटोकॉल, या कम समय के अंतराल के साथ संयोजन में सेटिंग्स जो उच्च जोखिम बार और / या उच्च उत्तेजना प्रकाश तीव्रता, जैसे, एक कम अभिव्यक्ति के स्तर के साथ प्रोटीन की आवश्यकता होती है visualizing के लिए इस्तेमाल किया जा सकता इमेजिंग, जैसे, समय चूक इमेजिंग के दौरान बीच। यह भी इमेजिंग पूरे सेल फैले वस्तुओं के लिए फायदेमंद हो सकता है, जैसे, सूक्ष्मनलिकाएं, इन सेटिंग्स ऑप्टिकल जेड वर्गों के एक उच्च संख्या की आवश्यकता के रूप में।
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no Acknowledgements.
Materials
| AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| MG132 | Sigma | C2211 | |
| Lactacystin | Sigma | L6785 | |
| Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
| Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
| MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
| CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartments glass bottom imaging dish |
| Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
| Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
| Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |
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