ارتفاع الدهون تغذية النموذج لليرقات اسماك الزرد: التغذية، يعيش التصوير، والكمي لتناول الطعام
Summary
Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques.
Abstract
Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich meal, which consists of an emulsion of chicken egg yolk liposomes created by sonicating egg yolk in embryo media. Detailed instructions are provided to screen larvae for egg yolk consumption so that larvae that fail to feed will not confound experimental results. The chicken egg yolk liposomes can be spiked with fluorescent lipid analogs, including fatty acids and cholesterol, enabling both systemic and subcellular visualization of dietary lipid processing. Several methods are described to mount larvae that are conducive to short- and long-term live imaging with both upright and inverted objectives at high and low magnification. Additionally presented is an assay to quantify larval food intake by extracting the lipids of larvae fed fluorescent lipid analogs, spotting the lipids on a thin layer chromatography plate, and quantifying the fluorescence. Finally, critical aspects of the procedures, important controls, options for modifying the protocols to address specific experimental questions, and potential limitations are discussed. These techniques can be applied not only to focused, hypothesis driven inquiries, but also to a variety of screens and live imaging techniques to study dietary lipid metabolism and the control of food intake.
Introduction
الآليات التي الأمعاء وينظم معالجة الدهون الغذائية، يتحكم الكبد معقد تركيب الدهون والبروتين الدهني التمثيل الغذائي، وكيف تعمل هذه الأجهزة مع الجهاز العصبي المركزي للسيطرة على استهلاك المواد الغذائية غير مفهومة تماما. ومن المثير للاهتمام الطبية الحيوية لتوضيح هذه الأحياء في ضوء الأوبئة الحالية من السمنة وأمراض القلب والأوعية الدموية، والسكري، وغير الكحولية مرض الكبد الدهني. وقد وفرت دراسات في زراعة الخلايا والفئران غالبية فهمنا للعلاقات الآلية بين الدهون الغذائية والمرض، والزرد (دانيو rerio) والناشئة باعتبارها نموذجا مثاليا لتكمل هذا العمل.
الزرد يكون الجهاز الهضمي مماثل (GI) أجهزة، التمثيل الغذائي للدهون، ونقل البروتين الدهني إلى الفقاريات العليا 1،2، تتطور بسرعة، وولين العريكة وراثيا. وضوح البصرية من الزرد اليرقات يسهل الدراسات المجراة، وparticulaميزة ص لدراسة نظام GI كما محيطها خارج الخلية (أي الصفراء، والجراثيم، والغدد الصماء الإشارات) يكاد يكون من المستحيل لنموذج خارج الحي. وفقا، مجموعة من البحوث التي تجمع بين قابلية الإستطراق الجيني والسببية للعيش التصوير من يرقات الزرد مع مجموعة متنوعة من التلاعب الغذائية (نسبة عالية من الدهون 3،4، -cholesterol 5، والوجبات الغذائية -carbohydrate 6،7)، ونماذج من مرض القلب والأوعية الدموية 8، مرض السكري 9،10، الكبد تنكس دهني 11-13، والسمنة 14-16، والناشئة لتقديم مجموعة من الأفكار التمثيل الغذائي.
جانبا أساسيا من الانتقال الزرد اليرقات في أبحاث الأيض هو تعظيم الاستفادة من التقنيات المتقدمة في الحيوانات نموذج الأخرى في الزرد وتطوير فحوصات جديدة التي تستغل نقاط القوة الفريدة من الزرد. ويعرض هذا البروتوكول التقنيات المتقدمة والأمثل لتغذية اليرقات الزرد في معهد العلوم الإندونيسيد غنية وجبة، تصور معالجة الدهون الغذائية من الجسم كله لقرار التحت خلوية، وقياس الاستهلاك الغذائي. وقد تم اختيار الدجاج وصفار البيض لتكوين وجبة غنية بالدهون لأنها تحتوي على مستويات عالية من الدهون والكوليسترول (الدهون يؤلف ~ 58٪ من صفار البيض والدجاج، منها ~ 5٪ هي نسبة الكوليسترول، و 60٪ من الدهون الثلاثية، و 35٪ من الدهون الفوسفاتية ). ويقدم الدجاج صفار البيض المزيد من الدهون من الأطعمة التقليدية التجارية الزرد micropellet (~ 15٪ نسبة الدهون) وميزة أنه تغذية موحدة مع النسب المعروفة أنواع معينة من الأحماض الدهنية، والحمية الغذائية الزرد وأفواج التغذية لم موحدة عبر مختبرات (17). وعلاوة على ذلك، النظير الدهون الفلورسنت المنصوص عليها في صفار البيض تصور النقل وتراكم الدهون الغذائية 18، والمكونات الخلوية الصور بما في ذلك قطرات الدهون من خلال العمل على حد سواء الأصباغ كما الحيوية 3 ومن خلال دمج التساهمية إلى الدهون المعقدة، والتحقيق في عملية التمثيل الغذائي من خلال رقيقة اللوني طبقة (TLC) 19 </sup> وعالية الأداء اللوني السائل (HPLC) (SAF بيانات غير منشورة)، وتوفير الفحص الكمي لمجموع الاستهلاك الغذائي 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأساليب المذكورة هنا تسمح للباحثين لعلاج الزرد اليرقات مع تغذية غنية بالدهون، تصور معالجة الدهون الغذائية في اليرقات الحية، وتحديد حجم الاستهلاك الغذائي اليرقات. لضمان النجاح، ينبغي إيلاء اهتمام خاص إلى العديد من الخطوات الهامة. بيض الدجاج التجارية تختلف. للحد من…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Meng-Chieh Shen for images, Jennifer Anderson for providing helpful comments on the manuscript, and members of the Farber laboratory for their contributions in developing these techniques. This study was funded by NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F), and F32DK096786 (J.P.O.). This content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of NIH. Additional support was provided by the G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation to the laboratory of S.A.F and the Carnegie Institution for Science endowment.
Materials
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Anesthesia for larval zebrafish |
| Chicken eggs | N/A | N/A | Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids |
| Ultrasonic processor 3000 sonicator | Misonix, Inc. | S-3000 | To make egg yolk liposomes |
| Sonabox acoustic enclosure | Misonix, Inc. | 432B | To make egg yolk liposomes |
| 1/8” tapered microtip | Misonix, Inc. | 419 | To make egg yolk liposomes |
| Amber vials (4 ml, glass) | National Scientific | 13-425 | Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa |
| Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Incubated shaker for feeds |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid) |
| BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid) |
| TopFluor cholesterol | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol |
| Fatty acid-free BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | For TopFluor cholesterol solubilization |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm |
| Low melt agarose | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Mounting media for live larval imaging; 22 x 30 |
| VWR microscope slides | VWR | 16004-422 | Mounting larvae for live imaging |
| Coverslips | Cover Glass | 12-544A | Mounting larvae for live imaging |
| Super glue | Loctite | LOC01-30379 | Mounting larvae for live imaging |
| FluoroDish (glass bottom dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness |
| Confocal microscope | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Microscope for high magnification live imaging |
| Stereoscope | Nikon | SM21500 | Microscope for low magnification live imaging |
| Glass culture tubes | Kimble | 73500-13100 | Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml) |
| Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A | Lipid extraction |
| Channeled TLC plates | Whatman Scientific | WC4855-821 | Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued |
| Channeled TLC plates | Analtech, Inc. | 66911 | Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GE Healthcare | 9410 | Fluorescent plate reader for food intake assay |
| ImageQuant software | GE Healthcare | 29000605 | Analysis of food intake assay |
| 5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets | Kimble | 63A53WT | Transfering larvae |
References
- Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501 (2009).
- Babin, P. J., Vernier, J. M. Plasma lipoproteins in fish. J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).
- Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev Biol. 360 (2), 276-285 (2011).
- Marza, E., et al. Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit. Dev Dyn. 232 (2), 506-518 (2005).
- Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
- Fang, L., et al. Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio. Br J Nutr. 111 (5), 808-818 (2014).
- Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature. PLoS One. 8 (12), 81485 (2013).
- Fang, L., et al. In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish. J Clin Invest. 121 (12), 4861-4869 (2011).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
- Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136 (5), 865-875 (2009).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
- Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), 36474 (2012).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21 (9), 2042-2049 (2007).
- Watts, S. A., Powell, M., D’Abramo, L. R. Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition. ILAR J. 53 (2), 144-160 (2012).
- Farber, S. A., et al. Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters. Science. 292 (5520), 1385-1388 (2001).
- Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism. Dis Model Mech. 7 (7), 915-927 (2014).
- Otis, J. P., et al. Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake. Dis Model Mech. 8 (3), 295-309 (2015).
- Bligh, E., Dyer, W. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).
- Otis, J. P., Farber, S. A. Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism. Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).
- Andre, M., et al. Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis. Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PLoS One. 7 (12), 52549 (2012).
