High-fat Feeding Paradigm für Larval Zebrabärbling: Füttern, Live-Imaging und Quantifizierung der Nahrungsaufnahme
Summary
Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques.
Abstract
Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich meal, which consists of an emulsion of chicken egg yolk liposomes created by sonicating egg yolk in embryo media. Detailed instructions are provided to screen larvae for egg yolk consumption so that larvae that fail to feed will not confound experimental results. The chicken egg yolk liposomes can be spiked with fluorescent lipid analogs, including fatty acids and cholesterol, enabling both systemic and subcellular visualization of dietary lipid processing. Several methods are described to mount larvae that are conducive to short- and long-term live imaging with both upright and inverted objectives at high and low magnification. Additionally presented is an assay to quantify larval food intake by extracting the lipids of larvae fed fluorescent lipid analogs, spotting the lipids on a thin layer chromatography plate, and quantifying the fluorescence. Finally, critical aspects of the procedures, important controls, options for modifying the protocols to address specific experimental questions, and potential limitations are discussed. These techniques can be applied not only to focused, hypothesis driven inquiries, but also to a variety of screens and live imaging techniques to study dietary lipid metabolism and the control of food intake.
Introduction
Die Mechanismen, mit denen der Darm Nahrungslipid Verarbeitung reguliert, steuert die Leber komplexe Lipidsynthese und Lipoprotein-Metabolismus und wie diese Organe mit dem zentralen Nervensystem arbeiten Nahrungsaufnahme zu steuern, sind nicht vollständig verstanden. Es ist der biomedizinischen Interesse, diese Biologie in Anbetracht der aktuellen Epidemien von Fettleibigkeit, Herz-Kreislauf- Erkrankungen aufzuklären, Diabetes und nicht-alkoholische Fettlebererkrankung. Studien in der Zellkultur und Mäusen haben die Mehrheit der unser Verständnis der mechanistischen Beziehungen zwischen Nahrungslipiden und Krankheit, und Zebrabärbling (Danio rerio) sind , sich als ideales Modell zur Verfügung gestellt , diese Arbeit zu ergänzen.
Zebrabärblinge haben ähnliche gastrointestinale (GI) Organe, den Fettstoffwechsel und Lipoprotein Transport zu den höheren Wirbeltieren 1,2, entwickeln sich schnell und sind genetisch manipulierbaren. Die optische Klarheit des Larven Zebrabärbling erleichtert in vivo – Studien, eine particular Vorteil für das Studium des GI – System als extrazelluläre Milieu (dh, Galle, Mikrobiota, endokrine Signalisierung) ist praktisch unmöglich , zu modellieren , ex vivo. Entsprechend wird ein Körper der Forschung der genetischen Lenkbarkeit und Zuträglichkeit Kombination Bildgebung von Zebrabärblingembryonen zu leben eine Vielzahl von Nahrungs Manipulationen ( mit hohem Fettgehalt 3,4, -Cholesterin 5 und Kohlenhydrat – Diäten 6,7) und Modelle von kardiovaskulären Erkrankungen 8, Diabetes 9,10, Hepatosteatose 11-13 und Fettleibigkeit 14-16, entstehen eine Vielzahl von metabolischen Erkenntnisse zur Verfügung zu stellen.
Ein wesentlicher Aspekt der Larven Zebrabärbling in Stoffwechselforschung des Übergangs ist die Optimierung der in anderen Modelltiere auf den Zebrabärbling und die Entwicklung neuer Assays entwickelt Techniken, die die einzigartigen Stärken der Zebrabärbling nutzen. Dieses Protokoll stellt Techniken entwickelt und optimiert Larven Zebrabärbling zu füttern ein lipid-reiche Mahlzeit, zu visualisieren diätetischen Lipid Verarbeitung von ganzen Körper zu subzellulärer Auflösung, und die Nahrungsaufnahme zu messen. Chicken egg yolk wurde gewählt, um die lipidreichen Mahlzeit zu schreiben, da es ein hohes Maß an Fetten und Cholesterin enthält (Lipide komponieren ~ 58% der Hühner Eigelb, von denen ca. 5% Cholesterin, 60% Triglyceride sind, und 35% sind Phospholipide ). Chicken egg yolk bietet mehr Fett als typische kommerzielle Zebrabärbling Mikropellet Lebensmittel (~ 15% Lipide) und dem Vorteil , dass es eine standardisierte Feed mit bekannten Prozentsätze der spezifischen Fettsäuren Art ist, wie Zebrabärbling Diäten und Fütterungs Regimenter nicht über labs 17 standardisiert. Darüber hinaus visualisieren fluoreszierende Lipid – Analoga im Eigelb zur Verfügung gestellt Transport und Akkumulation von Nahrungslipiden 18, Bild Zellkomponenten einschließlich Lipidtröpfchen , die durch die beiden als Vitalfarbstoffe 3 und durch kovalente Einbindung in komplexe Lipide wirken, untersuchen Stoffwechsel durch Dünnschichtchromatographie (TLC) 19 </sup> Und Hochleistungs – Flüssigchromatographie (HPLC) (nicht veröffentlichte Daten SAF) und einen quantitativen Assay für die Gesamtnahrungsaufnahme 20 bereitzustellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebenen Techniken können Forscher Larven Zebrabärbling mit einer lipidreichen Futter, zu visualisieren diätetischen Lipid Verarbeitung in lebenden Larven und quantifizieren Larven die Nahrungsaufnahme zu behandeln. Um den Erfolg sicherzustellen, sollte besonderes Augenmerk auf einige kritische Schritte gegeben werden. Kommerzielle Hühnereier variieren; mögliche Variabilität zu minimieren, führen wir alle Tests auf Bio-Eier aus Käfigfreie Hühner, die nicht für Omega-3-Fettsäuren angereichert hab…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Meng-Chieh Shen for images, Jennifer Anderson for providing helpful comments on the manuscript, and members of the Farber laboratory for their contributions in developing these techniques. This study was funded by NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F), and F32DK096786 (J.P.O.). This content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of NIH. Additional support was provided by the G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation to the laboratory of S.A.F and the Carnegie Institution for Science endowment.
Materials
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Anesthesia for larval zebrafish |
| Chicken eggs | N/A | N/A | Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids |
| Ultrasonic processor 3000 sonicator | Misonix, Inc. | S-3000 | To make egg yolk liposomes |
| Sonabox acoustic enclosure | Misonix, Inc. | 432B | To make egg yolk liposomes |
| 1/8” tapered microtip | Misonix, Inc. | 419 | To make egg yolk liposomes |
| Amber vials (4 ml, glass) | National Scientific | 13-425 | Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa |
| Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Incubated shaker for feeds |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid) |
| BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid) |
| TopFluor cholesterol | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol |
| Fatty acid-free BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | For TopFluor cholesterol solubilization |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm |
| Low melt agarose | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Mounting media for live larval imaging; 22 x 30 |
| VWR microscope slides | VWR | 16004-422 | Mounting larvae for live imaging |
| Coverslips | Cover Glass | 12-544A | Mounting larvae for live imaging |
| Super glue | Loctite | LOC01-30379 | Mounting larvae for live imaging |
| FluoroDish (glass bottom dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness |
| Confocal microscope | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Microscope for high magnification live imaging |
| Stereoscope | Nikon | SM21500 | Microscope for low magnification live imaging |
| Glass culture tubes | Kimble | 73500-13100 | Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml) |
| Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A | Lipid extraction |
| Channeled TLC plates | Whatman Scientific | WC4855-821 | Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued |
| Channeled TLC plates | Analtech, Inc. | 66911 | Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GE Healthcare | 9410 | Fluorescent plate reader for food intake assay |
| ImageQuant software | GE Healthcare | 29000605 | Analysis of food intake assay |
| 5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets | Kimble | 63A53WT | Transfering larvae |
References
- Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501 (2009).
- Babin, P. J., Vernier, J. M. Plasma lipoproteins in fish. J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).
- Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev Biol. 360 (2), 276-285 (2011).
- Marza, E., et al. Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit. Dev Dyn. 232 (2), 506-518 (2005).
- Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
- Fang, L., et al. Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio. Br J Nutr. 111 (5), 808-818 (2014).
- Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature. PLoS One. 8 (12), 81485 (2013).
- Fang, L., et al. In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish. J Clin Invest. 121 (12), 4861-4869 (2011).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
- Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136 (5), 865-875 (2009).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
- Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), 36474 (2012).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21 (9), 2042-2049 (2007).
- Watts, S. A., Powell, M., D’Abramo, L. R. Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition. ILAR J. 53 (2), 144-160 (2012).
- Farber, S. A., et al. Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters. Science. 292 (5520), 1385-1388 (2001).
- Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism. Dis Model Mech. 7 (7), 915-927 (2014).
- Otis, J. P., et al. Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake. Dis Model Mech. 8 (3), 295-309 (2015).
- Bligh, E., Dyer, W. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).
- Otis, J. P., Farber, S. A. Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism. Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).
- Andre, M., et al. Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis. Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PLoS One. 7 (12), 52549 (2012).
