Utilisation d'une cartouche filtrante pour la filtration de l'eau et des échantillons d'extraction de l'ADN de l'environnement

Résumé

Nous décrivons un protocole pour la filtration d’échantillons d’eau avec une cartouche filtrante et l’extraction de l’ADN environnemental (ADNe) sans avoir à ouvrir le boîtier pour retirer le filtre. Ce protocole est développé pour le métacodage à barres de l’ADNe des poissons, mais s’applique également à l’ADNe d’autres organismes.

Résumé

Des études récentes ont démontré que l’utilisation de l’ADN environnemental (ADNe) des poissons était appropriée comme outil de surveillance non invasif. La plupart de ces études ont utilisé des filtres à fibres à disque pour collecter de l’ADNe à partir d’échantillons d’eau, bien qu’un certain nombre d’études microbiennes en milieu aquatique aient utilisé des cartouches filtrantes, car la cartouche a l’avantage de contenir de grands volumes d’eau et d’être généralement facile à utiliser. Nous fournissons ici un protocole pour la filtration des échantillons d’eau à l’aide de la cartouche filtrante et l’extraction de l’ADNe du filtre sans avoir à ouvrir le boîtier. Les principales parties de ce protocole consistent en 1) la filtration des échantillons d’eau (volumes d’eau ≤4 L ou >4 L) ; (2) l’extraction de l’ADN sur le filtre à l’aide d’un agitateur à rouleaux placé dans un incubateur préchauffé ; et (3) la purification de l’ADN à l’aide d’un kit commercial. Grâce à l’utilisation de ce protocole et des protocoles précédemment utilisés, nous effectuons une analyse de métabarcoding d’ADNe prélevé dans un immense bassin d’aquarium (7 500 m³) avec une composition d’espèces connue, et montrons le nombre d’espèces détectées par bibliothèque à partir des deux protocoles comme résultats représentatifs. Ce protocole a été développé pour le métacodage à barres de l’ADNe des poissons, mais il est également applicable à l’ADNe d’autres organismes.

Introduction

ADN de l'environnement (EDNA) dans les milieux aquatiques se réfère au matériel génétique trouvé dans la colonne d'eau. Des études récentes ont démontré l'utilité de EDNA pour détecter les poissons de divers milieux aquatiques, y compris les étangs, les rivières ^{1-3 4-8,} cours d' eau ^9, et l' eau de mer ^10-14. La plupart de ces études se sont concentrées sur la détection d'un seul ou de quelques invasive ^1,4-6,8,14 et rares ou menacées espèces ^3,9, alors que certaines études récentes ont tenté la détection simultanée de plusieurs espèces dans les communautés de poissons locales ....

Protocole

NOTE: Ce protocole ne traite pas des méthodes d'échantillonnage de l'eau et metabarcoding. L' eau peut être échantillonné de différentes manières en fonction des fins d'étude ¹⁶ et voir Miya et al. ¹² pour plus de détails sur les méthodes de metabarcoding en utilisant des amorces de MiFish. A noter que l'eau prélevée doit rester très froid et on le filtre en quelques heures pour éviter une dégradation de EdNA. A noter également que ce protocole implique l'utilisation d'un agitateur rotatif et un incubateur, et celui-ci doit être suffisamment grand pour accueillir l'ancien. En outre, une centrifugeuse qui ....

Résultats

Il est techniquement difficile d'isoler et de quantifier seulement EDNA de poissons de la EDNA en vrac extrait, parce que les amorces MiFish coamplify la région cible de certains vertébrés non-poissons, tels que les oiseaux et les mammifères, avec des produits de PCR de la même taille (env. 170 pb ) ^12. Au lieu de quantifier les poissons EDNA, nous effectuons MiFish metabarcoding analyse de EDNA à partir d'un réservoir d'aquarium avec la composition des es.......

Discussion

Dans de nombreuses études de metabarcoding en utilisant des échantillons environnementaux tels que l' eau et le sol, le traitement post-filtration de la cartouche filtrante est généralement la suivante ^24,25: 1) de coupe ouverte ou gerçures le boîtier avec des outils à main (coupe-tube ou une pince); 2) le retrait du filtre de la cartouche; et 3) la découpe du filtre en petits morceaux avec une lame de rasoir pour l'extraction d'ADN. Pour éviter de telles lourdes et longues procédures qui sont suj.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Panneau en maille	Iris Ohyama	MPP-3060-BE
Broche en métal	Iris Ohyama	MR12F
Support pour le panneau en maille	Pas de marque	4184-9507	disponible sur Amazon Japon
Sac en plastique de 1 L avec bouchon à vis	Yanagi	DP16-TN1000
Connecteur luer-lock mâle	ISIS	11620
Pointe de pipette de 10 ml	Eppendorf	0030 000.765
Flacon livre de 10 L avec valve	As One	1-2169-01
Filtre Sterivex-HV	Millipore	SVHVL10RC	désigné comme « cartouche filtrante » tout au long du ms et utilisé dans le protocole
Raccord Luer mâle	As One	1-7379-04
Raccord Luer femelle	As One	5-1043-14  ;   ;
Capuchon Luer d’entrée	ISIS	VRMP6
Capuchon Luer de sortie	ISIS	VRFP6
Tube à vide poussé	As One	6-590-01
Connecteur à vide	As One	6-663-02
Bouchon en silicone	As One	1-7650-07
Collecteur	As One	2-258-01
Aspirateur-GAS-1	As One	1-7483-21
DNeasy Blood & Kit de tissus (250)	Qiagen	69506
PowerWater Sterivex Kit d’isolation d’ADN	MO BIO	14600-50-NF	désigné comme « kit optionnel » dans le ms
Centrifugeuse de table	Kubota	Model 4000	Vitesse maximale 6 000 tr
/min Rotor à angle fixe	Kubota	AT-508C
Adaptateur pour tube conique de 15 ml	Kubota	055-1280
Solution de stabilisation de l’ARNlater	Thermo Fisher Scientific	AM7020
	Parafilm	PM992	désigné comme « film auto-obturant »