Die Verwendung einer Filterpatrone für die Filtration von Wasserproben und Extraktion von Umwelt-DNA
Summary
We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Abstract
Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Introduction
Umwelt DNA (EDNA) in der aquatischen Umwelt bezieht sich auf genetisches Material in der Wassersäule gefunden. Jüngste Studien zeigten den Nutzen von Edna für Fische aus verschiedenen Gewässern zu erfassen, einschließlich Teiche 1-3, Flüsse 4-8, Ströme 9 und Meerwasser 14.10. Die meisten dieser Studien konzentrierten sich auf Nachweis eines einzelnen oder wenigen invasive 1,4-6,8,14 und seltene oder bedrohte Arten 3,9, während einige neuere Studien gleichzeitigen Nachweis mehrerer Spezies in lokalen Fischgemeinschaften 7,9 versuchte, 12,13,15 und Mesokosmen 11,12.
Der zweite Ansatz ist "metabarcoding" genannt und Edna metabarcoding verwendet einen oder mehrere Sätze von PCR-Primer über taxonomisch diverse Proben eine Genregion auf coamplify. Dies wird durch die Bibliotheksvorbereitung mit Indexierungs- und Adapter-Addition und die indizierten Bibliotheken von einem Hochdurchsatz-Sequenzierung analysiert parallel sindPlattform. Kürzlich Miya et al. 12 entwickelte Universal-PCR – Primer für metabarcoding EDNA von Fischen (genannt "MiFish"). Die MiFish Primer zielen auf eine hypervariablen Region des mitochondrialen 12S-rRNA-Gens (163-185 bp), die ausreichende Informationen enthält Fische zu taxonomischen Familie, Gattung und Art zu identifizieren, mit Ausnahme einiger eng verwandten Artgenossen. Mit der Verwendung dieser Primer in EDNA metabarcoding, Miya et al. 12 erfasst mehr als 230 subtropische Meeresarten von Aquarien mit bekannten Artenzusammensetzung und Korallenriffe in der Nähe des Aquariums.
Während das Protokoll metabarcoding Optimierung natürlichem Meerwasser aufzunehmen mit einem Gehalt an EdNA Konzentration von Fischen unterschiedlicher haben wir bemerkt, dass die MiFish Primer gelegentlich die Zielregion für die nachfolgende Herstellung Bibliothek zu amplifizieren fehlgeschlagen. Eine der häufiger Grund für diese nicht erfolgreich PCR-Amplifikation ist der Mangel an ausreichender Mengen der template DNA in kleinen Mengen Wasser enthielt gefiltert (dh 1-2 L). Obwohl EDNA-Konzentration von einer bestimmten taxonomischen Gruppe vor der Verstärkung unerkennbar ist, Filtration von großen Wassermengen (> 1-2 L) wäre ein einfaches und wirksames Mittel sein, um mehr EDNA aus den Gewässern mit knappen Fischreichtum und Biomasse zu sammeln, wie zum Beispiel im offenen Meer und Tiefseeökosysteme.
Bezogen auf Platte Faserfiltern üblicherweise in einer Reihe von Fisch EDNA Forschung 16 verwendet, Filterpatronen haben den Vorteil , größere Wassermengen vor 17 Verstopfung zuvorkommend . Eigentlich eine aktuelle Studie zeigte großes Volumen (> 20 L) Filtration von Küstenmeerwasser Proben unter Verwendung von Filterkartuschen 18. Darüber hinaus werden sie einzeln verpackt und steril, und mehrere Schritte des experimentellen Arbeitsablauf kann in das Filtergehäuse durchgeführt werden, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination aus der Labor 19 reduziert wird . letztereMerkmal ist entscheidend für die EDNA metabarcoding, in denen die Gefahr einer Kontamination bleibt unter den größten experimentellen 20,21 herausfordert. Trotz dieser technischen Vorteile von Filterpatronen, es war nicht in EdNA Studien von Fischen mit zwei Ausnahmen 8,15 verwendet.
Hier bieten wir ein Protokoll für die Filtration von Wasserproben mit der Filterpatrone und Extraktion von Edna aus seinem Filter, ohne das Gehäuse öffnen zu schneiden zu müssen. Wir bieten auch zwei alternative Wasserfiltersysteme in Abhängigkeit von den Wassermengen (≤4 L oder> 4 l). Um die Leistungsfähigkeit des neu entwickelten Protokoll vergleichen und ein zuvor verwendetes Protokoll ein Glasfaserfilter in unserer Forschungsgruppe mit 12,14,22,23, führen wir EDNA metabarcoding Analyse von Meerwasser aus einem riesigen Aquarium (7500 m 3 ) mit bekannten Artenzusammensetzung und zeigen die Anzahl der nachgewiesenen Spezies aus den beiden Protokollen als repräsentative Ergebnisse abgeleitet. Dieses Protokoll hwie für metabarcoding EDNA von Fischen entwickelt, ist aber auch für Edna aus anderen Organismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vielen metabarcoding Studien unter Verwendung von Umweltproben wie Wasser und Boden, post-Filtrationsbehandlung der Filterpatrone ist in der Regel wie folgt 24,25: 1) Aufschneiden oder rissiger das Gehäuse mit Handwerkzeugen (Rohrschneider oder Zange); 2) Entfernen des Filters aus der Patrone; und 3) Schneiden des Filter in kleine Stücke mit einer Rasierklinge für die DNA-Extraktion. Um derartige umständliche und zeitraubende Verfahren zu vermeiden, die zu einer Verunreinigung im Labor anfällig sind, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported as basic research by CREST from the Japan Science and Technology Agency (JST) and by grants from JSPS/MEXT KAKENHI (Number 26291083) and the Canon Foundation to M.M. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
| Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
| 1-L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
| 10-mL pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 10-L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
| Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
| Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
| Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
| Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
| High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
| Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
| Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
| Manifold | As One | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
| Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
| Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
| Adaptor for a 15 mL conical tube | Kubota | 055-1280 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
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