Bruk av en filterpatron for filtrering av vannprøver og Utvinning av Miljø DNA

Summary

We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Abstract

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m³) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.

Introduction

Miljø DNA (Edna) i akvatiske miljøer refererer til genetisk materiale funnet i vannsøylen. Nyere studier har vist nytten av Edna for å oppdage fisk fra ulike akvatiske miljøer, inkludert dammer ^1-3, elver ^4-8, bekker ^9, og sjøvann ^10-14. De fleste av disse studiene fokusert på deteksjon av en enkelt eller noen få invasiv ^1,4-6,8,14 og sjeldne eller truede arter ^3,9, mens noen nyere studier forsøkt samtidig påvisning av flere arter i lokale fiskesamfunn ^{7,9, 12,13,15} og posene ^11,12.

Sistnevnte tilnærming kalles "metabarcoding" og Edna metabarcoding bruker ett eller flere sett med PCR primere til coamplify et gen region tvers taksonomisk ulike prøver. Dette etterfølges av bibliotek-preparat med indeksering og adapter tilsetning, og de indekserte bibliotekene blir analysert ved en high-throughput parallell sekvenseplattform. Nylig Miya et al. ¹² utviklet universell PCR primere for metabarcoding Edna fra fisker (kalt "MiFish"). De MiFish primere rettet mot en hypervariabel region av mitokondriell 12S rRNA-gen (163-185 bp) som inneholder tilstrekkelig informasjon til å identifisere fisk til taksonomisk familie, slekt og art med unntak av noen nær beslektede kongenere. Med bruk av disse primere i Edna metabarcoding, Miya et al. ¹² oppdaget mer enn 230 subtropiske marine arter fra akvariekummer med kjente artssammensetning og korallrev nær akvariet.

Mens optimalisere metabarcoding protokollen for å imøtekomme naturlig sjøvann med varierende grad av Edna konsentrasjon fra fisker, har vi lagt merke til at MiFish primere tidvis klarte å forsterke målområdet for påfølgende bibliotek forberedelse. En av de mer sannsynlige årsaker til dette mislykket PCR-amplifikasjon er mangel på tilstrekkelige mengder av template DNA som inneholdes i små mengder vann, filtrert (for eksempel 1-2 liter). Selv om Edna konsentrasjon fra en bestemt taksonomisk gruppe er ukjennelig før forsterkning, filtrering av store vannmengder (> 1-2 L) ville være en enkel og effektiv måte å samle mer Edna fra akvatiske miljøer med knappe fisk overflod og biomasse, slik som åpne hav og dypvanns økosystemer.

I forhold til disk fiber filtre konvensjonelt brukes i en rekke av fisk Edna forskning ^16, filterpatroner har fordelen av imøtekommende større vannmengder før tilstopping ^17. Egentlig en fersk undersøkelse viste stort volum (> 20 L) filtrering av kystsjøvannsprøver ved hjelp av filterpatroner ^18. I tillegg er de individuelt pakket og sterile, og flere trinn av den eksperimentelle arbeidsflyten kan utføres i filterhuset, og dermed redusere sannsynligheten for forurensning fra laboratoriet ^19. Sistnevntefunksjonen er kritisk for Edna metabarcoding, der risikoen for forurensning er fortsatt blant de største eksperimentelle utfordrer ^20,21. Til tross for disse tekniske fordelene ved filterpatroner, det har ikke vært brukt i Edna studier av fisk med to unntak ^8,15.

Her gir vi en protokoll for filtrering av vannprøver med filterpatronen og utvinning av Edna fra sitt filter uten å måtte kutte åpne huset. Vi tilbyr også to alternative vann filtrering systemer avhengig av vannmengder (≤4 L eller> 4 L). For å sammenligne resultatene av den nyutviklede protokoll og en tidligere brukt protokollen ved hjelp av et glassfiberfilter i vår forskningsgruppe ^12,14,22,23, vi utfører Edna metabarcoding analyse av sjøvann fra et stort akvarium tank (7500 m ³ ) med kjent artssammensetning, og viser antall oppdagede arter som stammer fra de to protokollene som representative resultater. Denne protokollen hsom er utviklet for metabarcoding Edna fra fisker, men er også anvendelig til Edna fra andre organismer.

Protocol

MERK: Denne protokollen omhandler ikke vannprøve og metabarcoding metoder. Vann kan prøves på ulike måter, avhengig av studieøyemed 16 og se Miya et al. 12 for detaljer om metabarcoding metoder ved hjelp MiFish primere. Legg merke til at det samplede vann bør holdes meget kaldt og filtrert i løpet av noen få timer for å unngå degradering av Edna. Merk også at denne protokollen involverer anvendelse av en rotasjonsrister og en inkubator, og den sistnevnte må være store nok til …

Representative Results

Det er teknisk vanskelig å isolere og kvantifisere bare fisk Edna fra den ekstraherte masse Edna, fordi MiFish primere coamplify målområdet fra noen ikke-fisk virveldyr, slik som fugler og pattedyr, med PCR-produkter av samme størrelse (ca. 170 bp ) 12. I stedet for å kvantifisere fisk Edna, utfører vi MiFish metabarcoding analyse av Edna fra et akvarium tank med kjente artssammensetningen ved hjelp av to ulike metoder for filtrering og DNA-ekstraksjon, og samme…

Discussion

I mange metabarcoding studier med miljøprøver slik som vann og jord, etter filtrering behandling av filterpatronen er generelt som følger ^24,25: 1) skjære åpen eller sprekkdannelse i huset med håndverktøy (slange kutter eller tang); 2) fjerning av filteret fra kassetten; og 3) kutting av filteret i små biter med et barberblad for DNA-ekstraksjon. For å unngå slike tungvint og tidkrevende prosedyrer som er utsatt for forurensning i laboratoriet, har vi forsøkt flere DNA utvinning metoder innenfor hu…

Materials

Mesh panel	Iris Ohyama	MPP-3060-BE
Metal prong	Iris Ohyama	MR12F
Stand for the mesh panel	No brand	4184-9507	available from Amazon Japan
1-L plastic bag with screw cap	Yanagi	DP16-TN1000
Male luer-lock connector	ISIS	11620
10-mL pipette tip	Eppendorf	0030 000.765
10-L book bottle with valve	As One	1-2169-01
Sterivex-HV filter	Millipore	SVHVL10RC	denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol
Male luer fitting	As One	1-7379-04
Female luer fitting	As One	5-1043-14
Inlet luer cap	ISIS	VRMP6
Outlet luer cap	ISIS	VRFP6
High vacuum tubing	As One	6-590-01
Vacuum connector	As One	6-663-02
Silicone stopper	As One	1-7650-07
Manifold	As One	2-258-01
Aspirator-GAS-1	As One	1-7483-21
DNeasy Blood & Tissue Kit (250)	Qiagen	69506
PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit	MO BIO	14600-50-NF	denoted as "optional kit" in the ms
Tabletop Centrifuge	Kubota	Model 4000	Maximum speed 6,000 rpm
Fixed-angle rotor	Kubota	AT-508C
Adaptor for a 15 mL conical tube	Kubota	055-1280
RNAlater Stabilization Solution	Thermo Fisher Scientific	AM7020
	Parafilm	PM992	denoted as "self-sealing film"