Использование фильтра картриджа для фильтрации проб воды и экстракции ДНК окружающей среды
Summary
We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Abstract
Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Introduction
Экологическая ДНК (Эдна) в водной среде относится к генетическому материалу, найденной в толще воды. Недавние исследования показали полезность Эдна для обнаружения рыбы из различных водных средах, в том числе прудов, рек 1-3 4-8, потоки 9 и морской воды 10-14. Большинство этих исследований сосредоточено на выявлении одного или нескольких инвазивных 1,4-6,8,14 и редких или исчезающих видов 3,9, в то время как некоторые недавние исследования попытались одновременное обнаружение нескольких видов в местных сообществах рыб 7,9, 12,13,15 и мезокосмах 11,12.
Последний подход называется "metabarcoding" и Эдна metabarcoding использует один или несколько наборов праймеров ПЦР для coamplify область гена через таксономически различных образцов. За этим следует библиотекой препарата с индексацией и адаптером Кроме того, и индексированного библиотеки анализируют с помощью высокопроизводительного параллельного секвенированияПлатформа. Недавно Мия и др. 12 разработали универсальные ПЦР – праймеров для metabarcoding Эдна из рыб ( так называемые "MiFish"). В MiFish праймеры целевой гипервариабельной области митохондриального гена 12S рРНК (163-185 п.н.), который содержит информацию, достаточную для идентификации рыб к таксономической семьи, рода и вида для некоторых близких сородичей за исключением. С использованием этих праймеров в Эдна metabarcoding, Мия и др. 12 было обнаружено более 230 видов субтропических морских из аквариумов с известными видовой состав и коралловых рифов вблизи аквариума.
При оптимизации протокола metabarcoding для размещения естественной морской воды с различными уровнями концентрации Эдна от рыб, мы заметили, что MiFish праймеры иногда не в состоянии усилить целевой регион для последующей подготовки библиотеки. Одной из наиболее вероятных причин этого неудачного ПЦР-амплификации является отсутствие достаточного количества ТЕmplate ДНК , содержащаяся в небольших объемах воды фильтруются (т.е. 1-2 л). Хотя концентрация Эдна из определенной таксономической группы непознаваема до усиления, фильтрации больших объемов воды (> 1-2 л) будет простым и эффективным средством, чтобы собрать больше Эдна из водной среды с дефицитного обилием рыбы и биомассы, таких как открытого океана и глубоководных экосистем.
По сравнению с фильтрами дисковых волокна , обычно используемые в количестве рыбы Едне исследований 16, фильтровальные патроны имеют преимущество размещения больших объемов воды до забивания 17. На самом деле, недавнее исследование показало , большой объем (> 20 л) фильтрации проб морской воды с использованием береговых картриджей фильтра 18. Кроме того, они индивидуально упакованы и стерильны, и несколько шагов экспериментального процесса может быть выполнена в корпусе фильтра, таким образом , снижая вероятность загрязнения из лаборатории 19. Последнийфункция имеет решающее значение для Эдна metabarcoding, в которых риск заражения остается одной из крупнейших экспериментальная проблемы 20,21. Несмотря на эти технические преимущества фильтровальных патронов, он не был использован в исследованиях Эдна рыб с двумя исключениями 8,15.
Здесь мы предлагаем протокол для фильтрации проб воды с фильтром и патроном извлечения Эдна из его фильтра без необходимости разрезать корпус. Мы также предлагаем две альтернативные системы фильтрации воды в зависимости от объемов воды (≤4 л или> 4 л). Для сравнения эффективности вновь разработанного протокола и ранее используемый протокол , используя фильтр из стекловолокна в нашей исследовательской группе 12,14,22,23, мы выполняем Эдна metabarcoding анализ морской воды из огромного аквариума бака (7,500 м 3 ) с известной видовой состав, и показывают количество обнаруженных видов, полученных из двух протоколов в качестве представителя результатов. Этот протокол ч, как были разработаны для metabarcoding Эдна от рыб, но также применимо к Эдна из других организмов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Во многих исследованиях metabarcoding с использованием проб окружающей среды , такие как вода и почва, лечение после фильтрации картриджа фильтра , как правило , следующим образом 24,25: 1) разрезав или растрескиванию корпус с ручным инструментом (резцом насосно – компрессорных труб или пло…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported as basic research by CREST from the Japan Science and Technology Agency (JST) and by grants from JSPS/MEXT KAKENHI (Number 26291083) and the Canon Foundation to M.M. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
| Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
| 1-L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
| 10-mL pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 10-L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
| Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
| Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
| Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
| Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
| High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
| Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
| Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
| Manifold | As One | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
| Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
| Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
| Adaptor for a 15 mL conical tube | Kubota | 055-1280 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
References
- Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584 (2013).
- Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868 (2012).
- Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
- Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
- Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
- Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316 (2013).
- Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
- Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
- Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520 (2013).
- Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732 (2012).
- Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
- Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088 (2015).
- Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
- Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a ‘snapshot’ of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786 (2016).
- Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
- Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA – a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
- Stewart, F. J., DeLong, E. E. . Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. 10, 187-218 (2013).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161 (2009).
- Smalla, K., Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. . Molecular Microbial Ecology Manual. , 13-22 (1995).
- Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA – An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
- Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383 (2015).
- Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
- Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
- Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
- Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
- Deiner, K., Walser, J. -. C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
- Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
- Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A., Micic, M. . Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples’Springer Protocols Handbooks. , 325-339 (2016).
- Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
- Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
- Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
- Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).
