El uso de un cartucho de filtro para la filtración de agua Las muestras y extracción de ADN del Medio Ambiente
Summary
We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Abstract
Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Introduction
ADN Ambiental (Edna) en los ambientes acuáticos se refiere a material genético que se encuentra en la columna de agua. Estudios recientes han demostrado la utilidad de Edna para la detección de peces de diferentes ambientes acuáticos, incluyendo estanques, ríos 1-3 4-8, corrientes 9, 10-14 y agua de mar. La mayoría de estos estudios se centraron en la detección de una sola o unas pocas invasiva 1,4-6,8,14 y especies raras o amenazadas 3,9, mientras que algunos estudios recientes intentaron detección simultánea de múltiples especies en las comunidades locales de pescado 7,9, 12,13,15 y mesocosmos 11,12.
Este último enfoque se denomina "metabarcoding" y Edna metabarcoding utiliza uno o varios conjuntos de cebadores de PCR para coamplify una región génica a través de taxonómicamente diversas muestras. Esto es seguido por la preparación de la biblioteca con la indexación y la adición adaptador, y las bibliotecas de indexado se analizan mediante una secuenciación paralela de alto rendimientoplataforma. Recientemente Miya et al. 12 desarrollaron cebadores universales de PCR para metabarcoding Edna de peces (llamados "MiFish"). Los cebadores MiFish se dirigen a una región hipervariable del gen mitocondrial 12S rRNA (163-185 pb), que contiene información suficiente para identificar peces a la familia taxonómica, género y especie a excepción de algunos congéneres estrechamente relacionadas. Con el uso de estos cebadores en Edna metabarcoding, Miya et al. 12 detectaron más de 230 especies marinas subtropicales de tanques del acuario con conocidos composición de las especies y arrecifes de coral cerca del acuario.
Al tiempo que optimiza el protocolo metabarcoding para dar cabida a agua de mar natural con diferentes niveles de concentración de peces Edna, nos hemos dado cuenta de que los cebadores MiFish vez en cuando no amplificar la región diana para la posterior elaboración de la biblioteca. Una de las razones más probables para esta amplificación por PCR pierda falta de cantidades adecuadas de la teADN mplate contenida en pequeños volúmenes de agua filtrada (es decir, 1-2 L). Aunque la concentración de Edna de un grupo taxonómico específico es desconocido antes de la amplificación, filtración de grandes volúmenes de agua (> 1-2 L) sería un medio sencillo y eficaz para recoger más Edna de los ambientes acuáticos con escasa abundancia de peces y la biomasa, tales como de alta mar y de aguas profundas ecosistemas.
En relación con filtros de fibra de disco utilizado convencionalmente en una serie de investigaciones Edna pescado 16, cartuchos de filtro tienen la ventaja de acomodar volúmenes de agua más grandes antes de obstrucción 17. De hecho, un estudio reciente mostró gran volumen (> 20 l) de filtración de muestras de agua marina costeras que utilizan cartuchos de filtro 18. Además, se empaquetan individualmente y estéril, y varios pasos del flujo de trabajo experimental se pueden realizar en la carcasa del filtro, reduciendo así la probabilidad de contaminación del laboratorio 19. El últimocaracterística es crítica por Edna metabarcoding, en el que el riesgo de contaminación se mantiene entre los más grandes experimental desafía 20,21. A pesar de estas ventajas técnicas de cartuchos de filtro, no se ha utilizado en estudios Edna de peces con dos excepciones 8,15.
Aquí se proporciona un protocolo para la filtración de muestras de agua con el cartucho de filtro y extracción de Edna de su filtro sin tener que cortar y abrir la carcasa. También disponemos de dos sistemas de filtración de agua alternativos dependiendo de los volúmenes de agua (≤4 L o> 4 L). Para comparar el rendimiento del protocolo de nuevo desarrollo y un protocolo utilizado previamente utilizando un filtro de fibra de vidrio en nuestro grupo de investigación 12,14,22,23, realizamos Edna metabarcoding análisis de agua de mar de un gran tanque de acuario (7,500 m 3 ) con la composición de las especies conocidas, y mostrar el número de especies detectadas derivados de los dos protocolos como resultados representativos. Este protocolo hcomo se han desarrollado para metabarcoding Edna de peces, sino que también es aplicable a Edna de otros organismos.
Protocol
Representative Results
Discussion
En muchos estudios metabarcoding utilizando muestras ambientales tales como el agua y el suelo, el tratamiento post-filtración del cartucho de filtro es generalmente como sigue 24,25: 1) de corte abierto o formación de grietas de la carcasa con herramientas de mano (cortador de tubos o pinzas); 2) la retirada del filtro del cartucho; y 3) cortar el filtro en pequeños trozos con una cuchilla de afeitar para la extracción de ADN. Para evitar este tipo de varios métodos de extracción de ADN engorroso y con…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported as basic research by CREST from the Japan Science and Technology Agency (JST) and by grants from JSPS/MEXT KAKENHI (Number 26291083) and the Canon Foundation to M.M. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
| Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
| 1-L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
| 10-mL pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 10-L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
| Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
| Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
| Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
| Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
| High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
| Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
| Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
| Manifold | As One | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
| Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
| Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
| Adaptor for a 15 mL conical tube | Kubota | 055-1280 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
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