We describe a protocol for filtration of water samples with a filter cartridge and extraction of environmental DNA (eDNA) without having to cut open the housing to remove the filter. This protocol is developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies employed disk fiber filters to collect eDNA from water samples, although a number of microbial studies in aquatic environments have employed filter cartridges, because the cartridge has the advantage of accommodating large water volumes and of overall ease of use. Here we provide a protocol for filtration of water samples using the filter cartridge and extraction of eDNA from the filter without having to cut open the housing. The main portions of this protocol consists of 1) filtration of water samples (water volumes ≤4 L or >4 L); (2) extraction of DNA on the filter using a roller shaker placed in a preheated incubator; and (3) purification of DNA using a commercial kit. With the use of this and previously-used protocols, we perform metabarcoding analysis of eDNA taken from a huge aquarium tank (7,500 m3) with known species composition, and show the number of detected species per library from the two protocols as the representative results. This protocol has been developed for metabarcoding eDNA from fishes, but is also applicable to eDNA from other organisms.
Miljö DNA (eDNA) i vattenmiljöer avser genetiska material som finns i vattnet. Nya studier har visat användbarheten av eDNA för detektering av fiskar från olika vattenmiljöer, inklusive dammar 1-3, floder 4-8, strömmar 9, och havsvatten 10-14. De flesta av dessa studier fokuserade på detektion av en enda eller ett fåtal invasiv 1,4-6,8,14 och sällsynta eller hotade arter 3,9, medan några nya studier försökt samtidig detektion av flera arter i lokala fisksamhällen 7,9, 12,13,15 och mesokosmosstudier 11,12.
Den senare metoden kallas "metabarcoding" och Edna metabarcoding använder en eller flera uppsättningar av PCR-primers för att coamplify en genregion över taxonomiskt skilda prover. Detta följs av biblioteket förberedelse med indexering och adapter dessutom och indexerade bibliotek analyseras av en hög genomströmning parallell sekvenseplattform. Nyligen Miya et al. 12 utvecklade universella PCR-primers för metabarcoding eDNA från fiskar (kallas "MiFish"). De MiFish primers rikta en hypervariabel region av den mitokondriella 12S rRNA-genen (163-185 bp), som innehåller tillräcklig information för att identifiera fiskar till taxonomiska familj, släkte och art, utom för vissa närbesläktade kongener. Med hjälp av dessa primers i Edna metabarcoding, Miya et al. 12 upptäckt mer än 230 subtropiska marina arter från akvarier med kända artsammansättning och korallrev i närheten akvariet.
Medan optimera metabarcoding protokollet att rymma naturliga havsvatten med olika nivåer av eDNA koncentration från fiskar, har vi märkt att MiFish primers ibland misslyckades att förstärka målområdet för efterföljande bibliotek beredning. En av de mer troliga orsakerna till detta misslyckade PCR-förstärkning är brist på tillräckliga mängder av template DNA som finns i små mängder vatten filtrerade (dvs 1-2 L). Även eDNA koncentration från en viss taxonomisk grupp är omöjlig innan förstärkning, filtrering av stora vattenvolymer (> 1-2 L) skulle vara ett enkelt och effektivt sätt att samla in mer eDNA från vattenmiljöer med knappa fisk förekomst och biomassa, såsom öppen havet och djuphavsekosystem.
I förhållande till skivfiberfilter som konventionellt används i ett antal fiskar eDNA forskning 16, filterpatroner har fördelen att ta emot större vattenvolymer innan igensättning 17. Egentligen en nyligen genomförd studie visade stor volym (> 20 L) filtrering av kusthavsvattenprover som använder filterpatroner 18. Dessutom, de är individuellt förpackade och steril, och flera steg av den experimentella arbetsflödet kan utföras i filterhuset, vilket minskar sannolikheten för kontaminering från laboratoriet 19. Den senareFunktionen är avgörande för eDNA metabarcoding, där risken för kontaminering är fortfarande bland de största experimentella utmaningar 20,21. Trots dessa tekniska fördelar av filterpatroner, har det inte använts i Edna studier av fiskar med två undantag 8,15.
Här ger vi ett protokoll för filtrering av vattenprover med filterpatronen och utvinning av eDNA från sin filter utan att behöva skära upp höljet. Vi tillhandahåller också två alternativa vattenfiltreringssystem beroende på volymer vatten (≤4 L eller> 4 L). För att jämföra prestanda nyutvecklade protokoll och en tidigare protokoll som används med hjälp av en glasfiberfilter i vår forskargrupp 12,14,22,23, vi utför eDNA metabarcoding analys av havsvatten från en enorm akvarium (7500 m 3 ) med känd artsammansättning och visar antalet upptäckta arter som härrör från de två protokoll som representativa resultat. Detta protokoll hsom utvecklats för metabarcoding eDNA från fiskar, men är också tillämpbar på eDNA från andra organismer.
I många metabarcoding studier med miljöprov såsom vatten och mark, är i allmänhet efterfiltreringsbehandling av filterpatronen enligt följande 24,25: 1) skära upp eller sprickbildning huset med handverktyg (slang cutter eller tång); 2) avlägsnande av filtret från patronen; och 3) att skära filtret i små bitar med ett rakblad för DNA-extraktion. För att undvika sådana besvärliga och tidskrävande förfaranden som är benägna att kontaminering i laboratoriet, har vi försökt flera DNA extrakti…
The authors have nothing to disclose.
This study was supported as basic research by CREST from the Japan Science and Technology Agency (JST) and by grants from JSPS/MEXT KAKENHI (Number 26291083) and the Canon Foundation to M.M. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
1-L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
10-mL pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
10-L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
Manifold | As One | 2-258-01 | |
Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
Adaptor for a 15 mL conical tube | Kubota | 055-1280 | |
RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |