De rol van het assortiment (ruimtelijke segregatie) in de evolutionaire scenario's kunnen worden onderzocht met behulp van eenvoudige microbiële systemen in het laboratorium die het mogelijk maken gecontroleerde aanpassing van de ruimtelijke verdeling. Door wijziging van de oprichter celdichtheid, kunnen diverse assortiment niveaus worden gevisualiseerd met behulp van fluorescent gelabelde bacteriestammen in de kolonie biofilms van Bacillus subtilis.
Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.
In de afgelopen decennia zijn microben erkend als social communities in verband met diverse ecosystemen op aarde 1,2. In tegenstelling tot planktonische culturen die in het algemeen laboratorium praktijk microben in het milieu tonen een breed scala van ruimtelijke community structuren, afhankelijk van de natuurlijke omgeving. Eenvoudige microbiële systemen kunnen worden gebruikt om de gevolgen van ruimtelijke structuren op de evolutie van sociale interacties 3,4 begrijpen. Publicaties in de laatste 2-3 jaar gebruikt zowel eukaryotische als prokaryotische modelsystemen benadrukt het effect van ruimtelijke structuren op de stabiliteit van de samenwerking binnen microbiële populaties 5-8. Bovendien obligate interacties tussen microben, zoals metabolische cross-feeding, zou ook de ruimtelijke verdeling van interagerende partners 9-11 veranderen. De invloed van de ruimtelijke structuur in deze studies wordt meestal onderzocht met behulp van het oppervlak bevestigd sessiele cellen bevolken de zogenaamde-called biofilms of kolonies groeien op het oppervlak van een agarmedium. Genetische drift leidt tot hoge ruimtelijke assortiment waarneembaar in microbiële kolonies wanneer tekort aan nutriënten aan de rand van een celdeling gemedieerde expansie leidt reeks genetische knelpunten hoge plaatselijke fixatie waarschijnlijkheid bepaalde klonale linages 12 veroorzaakt. Genetische drift kan derhalve worden toegepast om de rol van ruimtelijke segregatie in microbiële kolonies onderzocht.
In het milieu, biofilms zijn multispecies gemeenschappen omringd door zelf geproduceerde polymeer matrix 13. Biofilm structuur, functie en de stabiliteit afhankelijk van een complex netwerk van sociale interacties, waar bacteriën wisselen signalen, matrix componenten en middelen, of concurreren voor ruimte en voedingsstoffen met behulp van giftige stoffen en antibiotica. Bacillus subtilis is een bodem levende en wortel koloniserende bacterie die sterk ontwikkelt georganiseerd biofilm gemeenschappen 14. Analoog aan socialeinsecten, B. subtilis cellen maken gebruik van een verdeling van arbeid strategie, de ontwikkeling van subpopulaties van extracellulaire matrix producenten en kannibalen, beweeglijke cellen, slapende sporen en andere celtypen 15,16. Het differentiatieproces is dynamisch en kan worden veranderd door omgevingsomstandigheden 17,18.
Strategieën oppervlaktekolonisatie door bacteriën kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd onder laboratoriumomstandigheden door aanpassing van de agar concentratie in het kweekmedium. Bij lage niveaus agar (0,2-0,3%), bacteriën herbergen actieve flagella in staat zijn om te zwemmen, terwijl de semi-vaste agar (0,7-1% agar) faciliteert flagellum gedreven gemeenschap verspreiden, genaamd zwermen 19-21. Aangezien flagellum bepaalde bacteriestammen kunnen via halfvast medium te bewegen via schuiven, ofwel groei afhankelijk populatie expansie vergemakkelijkt door exopolysaccharide matrix en andere uitgescheiden hydrofobine verbindingen 22-24. Tenslotte worden de bacteriën die zijn capable van de biofilm ontwikkeling vorm architectonisch complex kolonies op harde agar medium (1,2-2%) 14,17,25. Hoewel deze eigenschappen in het laboratorium onderzocht door nauwkeurig aanpassen van de omstandigheden in deze natuurlijke habitats oppervlak verspreiden strategieën kunnen transit geleidelijk van het ene naar het andere afhankelijk van de omgevingsomstandigheden 26. Hoewel enkele cel gebaseerde motiliteit kritisch bij aanvang van de biofilm ontwikkeling op het lucht-vloeistof-grensvlak in zowel Gram-positieve en -negatieve bacteriën 27, complex kolonie biofilms van B. subtilis worden niet beïnvloed door deletie van flagellaire beweeglijkheid 28. Echter, ruimtelijke organisatie gedurende de ontwikkeling van B. kolonie subtilis biofilms afhankelijk van de dichtheid van het bacteriële inoculum gebruikt om de biofilm 8 initiëren.
Hier gebruiken we B. subtilis aantonen dat ruimtelijke segregatie tijdens oppervlaktekolonisatie afhankelijk van het mechanisme van populatieniveau motility (dwz zwermen of schuifdeuren) en kolonie biofilm ontwikkeling hangt af van de oprichter celdichtheid. We presenteren een fluorescentiemicroscopie instrument dat kan worden toegepast om continu monitoren microbiële biofilmgroei, oppervlaktekolonisatie en assortiment Op macroschaal. Verder wordt een kwantitatieve methode voorgesteld om de relatieve abundantie rek in de populatie te bepalen.
De beschikbaarheid van een toolbox fluorescerende bacteriën bevordert niet alleen de studie van heterogene genexpressie 30,31 en eiwit lokalisatie 32, maar ook de analyse van de ruimtelijke verdeling van spanningen in een populatie 8. Fluorescente merkers met voldoende verschillende excitatie- en emissiegolflengte laten duidelijk lokaliseren twee stammen die anders niet te onderscheiden zijn van elkaar wanneer gemengd. De beschreven protocol kan worden gebruikt voor het observeren van de populatiedynamiek in gemengde culturen, bijvoorbeeld concurrentie experimenten of synergie tussen stammen of species. De mogelijkheid om de relatieve abundanties van fluorescent gemerkte stammen in een gemengde populatie te bepalen is niet beperkt bijgevoegde zwermen, glijden of biofilm kolonies oppervlak, maar kan ook worden gebruikt voor andere multicellulaire biofilm, waaronder ondergedompeld, stroomcel of lucht-medium-interface biofilms 27,33-35.
_content "> Hoewel de gepresenteerde techniek is een krachtig instrument om de ruimtelijke verdeling van de stammen en de concurrentie ontwerp experimenten op te sporen, het zorgt er ook volgende genexpressie heterogeniteit in de uitbreiding van kolonies. De hier beschreven kweekomstandigheden gelden voor B. subtilis en de exacte parameters voor uitbreiding op agar afdrukmateriaal optimalisatie van andere soorten of stammen 20 vereisen. het plaatsen van de monsters in een incubatiekamer terwijl imaging maakt de experimentator de populatiedynamiek volgen in de tijd, maar de aandacht moet worden geschonken aan de vochtigheidsgraad in de kamer tijdens de incubatie.De hier beschreven technieken vereisen ook de genetische modificatie van de onderzochte bacteriestammen zodat de stammen tot expressie fluorescente merkers die kunnen worden onderscheiden van elkaar. Bovendien, naast het hebben van verschillende excitatie- en emissiespectra, wordt aanbevolen dat de twee gekozen fluorescente merkers vergelijkbare quantum rendementen (dwz verhouding van de geabsorbeerde fotonen die worden uitgestoten) en worden uitgedrukt in een vergelijkbaar niveau. Bovendien kan relatieve intensiteit veranderingen in de tijd worden gemeten en genormaliseerd op een vroeg tijdpunt van een experiment. De relatieve toename of afname kan dan worden vergeleken tussen verschillende fluoroforen met verschillende kwantumefficiëntie. Voor de gepresenteerde experimentele systeem werden verschillende groen- en rood-fluorescerende eiwitten eerder geteste 36,37 om te selecteren op de meest optimale fluorescerende paren die in B kan worden gedetecteerd subtilis. De optimale belichtingstijd moet worden bepaald voor elke fluorescerend eiwit en monster. Bepaalde celdichtheden of meervoudige lagen van cellen nodig zijn om het signaal efficiënt binnen de populatie te detecteren. Bepaalde fluorescente proteïnen kunnen lage intensiteiten in de bacteriële cellen door inefficiënte expressie en / of translatie van het eiwit en dus lage opbrengst quantum hebben. Dergelijke ondoelmatige fluorescente merkers kunnen reduce de gevoeligheid van het systeem en verlengen de tijd die nodig is om de bacteriële stammen met mogelijke cytotoxiciteit door het excitatielicht te detecteren. De fluorescentie intensiteiten kunnen dienovereenkomstig worden gemodificeerd door wijziging van de promoter gebruikt om de fluorescente reporter coderende gen expressie. Een expressieniveau te hoog zou kunnen leiden tot onnodige overproductie van het fluorescerende eiwit leidt tot nadelige fitheidkosten voor de bacterie. Bij het uitvoeren van competitie-experimenten, moet men de kosten van specifieke fluorescerend eiwit productie in de cellen onderzocht. Controle-experimenten, waarbij de fluorescerende markers worden uitgewisseld tussen streden stammen of waar twee isogene stammen alleen verschillen in hun fluorescerende markers worden tegen elkaar, zijn altijd verplicht om elke neiging naar een marker te bepalen. De levensduur van de fluorescerende eiwitten in de cellen kan ook invloed hebben op de gemeten intensiteit. Bovendien, de autofluorescentie van bepaalde bacteriële species zou het gebruik van verschillende anders dan hier beschreven fluorescente merkers vereist.
De ruimtelijke verdelingen en abundanties van de verschillende bacteriestammen nauwkeurig te kunnen bepalen, moet het achtergrondsignaal afkomstig van de eerste fluorescerende eiwit tijdens het gebruik van de fluorescentie-filter voor de tweede fluorescerende merker en vice versa afzonderlijk getest op monocultuur monsters (met bacteriën die slechts één merker ). Hierdoor kan de aftrekking van overlappende fluorescerende signaalintensiteiten. Belangrijk, omdat de stereomicroscoop neemt het fluorescentiesignaal van boven de groeiende kolonie, de gepresenteerde protocol is handig om de ruimtelijke rangschikking bepalen twee dimensies. De architectuur van de groeiende bacteriepopulatie kan resulteren in variërende fluorescentieniveaus (dwz rimpel structuren mogelijk meer cellen die hogere lokale fluorescentie intensiteiten bevatten). Daarom is de beschreven analyse van de beelden determines de ruimtelijke verdeling, maar niet de overvloed van de spanningen binnen een bepaalde locatie. Vorige protocollen beschreef het monster voorbereiding zwermen 20 of fluorescentie beeldvorming van de populatiedynamiek in bacteriekolonies 38, maar ons protocol combineert deze technieken. Andere microscopische technieken dat de waarneming van driedimensionale resolutie van de bevolking structuur (zoals confocale laser scanning microscopie 39,40 of gestructureerde verlichting microscopie 41) toe kan worden toegepast voor monsters met hogere structurele complexiteit. Deze aanvullende technieken ondersteunen ook enkele cel gebaseerde detectie van de stammen 31 die niet beschikbaar is met behulp van stereomicroscopen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door subsidie KO4741 / 3-1 van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Verder, het laboratorium van Á.TK werd ondersteund door een Marie Curie-Skłodowska carrière integratie subsidie (PheHetBacBiofilm) en het verlenen van KO4741 / 2-1 van DFG. TH, AD, RG-M., En EM werden ondersteund door International Max Planck Research School, Alexander von Humboldt Stichting, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia-Duitse Academic Exchange Service (CONACyT-DAAD) en JSMC beurzen, respectievelijk.
Lennox Broth (LB) | Carl Roth GmbH | X964 | |
Agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH | 5210 | |
Petri dish (90 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
Petri dish (35 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
Difco Nutrient Broth | BD Europe | 234000 | |
KCl | any | NA | |
MgSO4 7H2O | any | NA | |
Ca(NO3)2 4H2O | any | NA | |
MnCl24H2O | any | NA | |
FeSO4 | any | NA | |
D-Glucose | any | NA | |
Fluorescence AxioZoom V16 time-lapse microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | see bellow detailed description | |
AxioZoom V16 Microscope body | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435080 9030 000 | |
Phototube Z 100:0 for Axio Zoom V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9020 000 | without eyepieces |
Fluar Illuminator Z mot Fluorescence intermediate tube for Axio Zoom.V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9060 000 | |
Controller EMS 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435610 9010 000 | |
System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435611 9010 000 | |
Reflector module Z | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9160 000 | For Fluar Illuminator Z mot on Axio Zoom.V16 and SYCOP 3 |
Filter set 38 HE eGFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489038 9901 000 | EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50 |
Filter set 63 HE mRFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489063 0000 000 | EX BP 572/25, BS FT 590, EM BP 629/62 |
Mount S | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435402 0000 000 | |
Objektive PlanApo Z 0,5x/0,125 FWD 114mm | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435280 9050 000 | 164mm parfocal length; M62x0.75 thread at front |
Coarse/fine drive with profile column | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435400 0000 000 | 490 mm, 10kg load capacity, compatible with stand bases 300/450 |
Stand base 450 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435430 9902 000 | |
Cold-light source Zeiss CL 9000 LED CAN | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435700 9000 000 | |
CAN-bus cable | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 457411 9011 000 | 2.5 m length |
Slit-ring illuminator | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417075 9010 000 | d=66 mm |
Flexible light guide 1500 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417063 9901 000 | 8/1000 mm |
Illumination Adapter for light guide | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 1370 927 | |
Lightguide HXP with liquid fill | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 0482 760 | ø3mm x 2000mm |
Camera Adapter 60N-C | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426113 0000 000 | 2/3" 0.63x |
High Resolution Microscopy Camera AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426509 9901 000 | |
AxioCam FireWire Trigger Cable Set | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426506 0002 000 | for direct shutter synchronization |
ZEN pro 2012 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410135 1002 120 | Blue edition, requires min. Windows 7 64-bit |
ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410136 1031 110 | |
Standard Heating Stage Top Incubator | Tokai Hit | INUL-MS1-F1 | |
Zeiss Stereo Microscope Base Adapter | Tokai Hit | MS-V12 | |
Softwares | |||
Image J | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | v 1.49m | |
BioVoxxel plugin | BioVoxxel | http://www.biovoxxel.de/development/ |