Le Neuron-astrocyte indirecte coculture Assay: Un<em> In vitro</em> Mise en place pour l'investigation détaillée des interactions Neuron-glie
Summary
Ce protocole décrit la coculture neurone-astrocyte indirect pour l'analyse compartimentée des interactions neurone-glie.
Abstract
le développement neuronal et la fonction est la condition préalable du développement et le cerveau adulte. Cependant, les mécanismes sous-jacents de la formation hautement contrôlé et l'entretien des réseaux neuronaux complexes ne sont pas complètement compris jusqu'à présent. Les questions ouvertes concernant les neurones dans la santé et la maladie sont diverses et allant de la compréhension du développement de base aux enquêtes sur les droits liés à des pathologies, par exemple, les maladies et la schizophrénie d'Alzheimer. L'analyse la plus détaillée de neurones peut être réalisé in vitro. Cependant, les neurones exigent des cellules et ont besoin du soutien supplémentaire de astrocytes pour leur survie à long terme. Cette hétérogénéité cellulaire est en conflit avec le but de disséquer l'analyse des neurones et des astrocytes. Nous présentons ici un essai de culture cellulaire qui permet la co-culture à long terme des neurones et des astrocytes primaires pures, qui partagent le même milieu chimiquement défini, tout en étant physiquementséparé. Dans cette configuration, les cultures survivent jusqu'à quatre semaines et le dosage est adapté à la diversité des enquêtes concernant les interactions neurone-glie.
Introduction
Tout au long des dernières décennies, l'interprétation générale de la fonction névroglie a évolué à partir de l'attribution d'un soutien simplement vers un rôle actif réglementaire concernant la fonction neuronale 1. En raison de leur impact important sur le cerveau homéostasie dans la santé et la maladie 2, astrocytes sont d' un intérêt particulier pour la communauté scientifique. Au cours des dernières années, une diversité d'études ont porté sur les interactions neurone-glie in vivo et in vitro 3. Cependant, la plupart des systèmes de culture ne permettent pas l'analyse séparée des deux types de cellules et de leurs secrétomes respectifs.
Plusieurs approches exploitent la coculture directe des neurones et des cellules gliales pour atteindre la survie à long durable et le développement du réseau neuronal physiologiquement pertinents 4-6. Le présent protocole atteint les mêmes objectifs tout en gardant les deux types de cellules physiquement séparés 7. Par rapport à conditionemoyen d approches 8,9, notre système permet d'étudier la communication bidirectionnelle entre les neurones et les astrocytes. L'expression des molécules de signalisation sécrétées peut être surveillée tandis que les cellules dans le milieu maturate partagé. Cette possibilité est particulièrement importante, car les astrocytes libèrent des facteurs solubles tels que les cytokines, les facteurs de croissance et des molécules de la matrice extracellulaire 10,11, régulant ainsi la croissance neuronale et fonctionnent de 7,12. Ainsi, il a été démontré que l'addition de la thrombospondine aux cellules ganglionnaires de la rétine in vitro induit la formation de synapses 13. Cependant, d' autres facteurs encore inconnus sont nécessaires pour rendre les synapses fonctionnelles 13. En outre, les molécules libérées par les astrocytes doivent être identifiés afin de comprendre la base des interactions neurone-glie.
La culture des neurones primaires et des astrocytes de rat et la souris a été décrit précédemment 14-16. ici, nousprésenter un outil élégant et polyvalent de combiner les deux types de cellules dans une approche indirecte de coculture. Étant donné que les deux cultures sont physiquement séparés encore partager le même milieu, l'impact des neurones, des astrocytes et des molécules solubles, peuvent être analysées séparément, créant ainsi un outil puissant pour les études d'interaction neurone-glie.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'objectif principal du protocole actuel est de cultures neuronales et astrocytaires complètement séparés, tout en les maintenant dans un milieu partagé. Pour cette raison, la pureté des cultures obtenues doivent être vérifiées au début de la procédure. Nous recommandons l'utilisation de la tubuline spécifique des neurones, neurofilaments ou protéine NeuN comme marqueurs neuronaux, GFAP comme marqueur astrocytaire, antigène O4 comme marqueur de précurseurs d'oligodendrocytes et de protéines Ib…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 “Glia and Synapse”, Fa 159/11-1,2,3).
Materials
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cell culture grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-ß-D arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24 well plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro tube (2 ml) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 ml) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 ml) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
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