voorbereiding en<em> In Vitro</em> Karakterisering van-dendrimeer gebaseerde Contraststoffen voor Magnetic Resonance Imaging
Summary
Dit protocol beschrijft de bereiding en karakterisering van een dendrimere magnetische resonantie imaging (MRI) contrastmiddel dat cyclen gebaseerde macrocyclische chelaten coördinerende paramagnetische gadolinium-ionen draagt. In een serie MRI-experimenten in vitro, deze agent produceerde een versterkte MRI signaal in vergelijking met de commercieel beschikbare monomere analoog.
Abstract
Paramagnetische complexen van gadolinium (III) met acyclische of macrocyclische chelaten zijn de meest gebruikte contrastmiddelen (CA) voor magnetische resonantie beeldvorming (MRI). Hun doel is om de versoepeling snelheid van water protonen in het weefsel te versterken, waardoor de MR beeldcontrast en de specificiteit van de MRI-metingen toeneemt. Huidige klinisch goedgekeurde contrastmiddelen vanaf hoogmoleculaire moleculen die snel uit het lichaam geklaard. Het gebruik van dendrimeren als dragers van paramagnetische chelaten kunnen een belangrijke rol spelen in de toekomstige ontwikkeling van efficiëntere MRI contrastmiddelen. Met name de toename van lokale concentratie van het paramagnetische soorten resulteert in een hoger signaal contrast. Bovendien is dit CA levert een langere retentietijd tissue tijd vanwege het hoge molecuulgewicht en grootte. Hier tonen we een geschikte procedure voor de bereiding van macromoleculaire MRI contrastmiddelen op basis van poly (amidoamine) (PAMAM) dendrimeren monomacrocyclische DOTA-type chelatoren (DOTA – 1,4,7,10-tetraazacyclododecaan-1,4,7,10-tetraacetaat). De chelerende eenheid werd toegevoegd door het benutten van de reactiviteit van het isothiocyanaat (NCS) groepen naar het oppervlak amine- groepen van de PAMAM dendrimeer te thioureum brugvorming. Dendrimere producten werden gezuiverd en geanalyseerd door middel van kernmagnetische resonantie spectroscopie, massaspectrometrie en elementanalyse. Tenslotte werden hoge resolutie MR beelden die zijn opgenomen en het signaal contrasten verkregen uit de voorbereide dendrimere en in de handel verkrijgbare monomeer agenten werden vergeleken.
Introduction
Magnetic resonance imaging (MRI) is een krachtige en niet-ioniserende beeldvormingstechniek schaal gebruikt in biomedisch onderzoek en klinische diagnostiek vanwege de invasieve aard en uitstekende intrinsieke zacht weefsel contrast. De meest gebruikte MRI methoden gebruiken het signaal verkregen uit water protonen leveren van hoge resolutie beelden en informatie binnen de weefsels op basis van verschillen in de dichtheid van het water signalen. De signaalintensiteit en de specificiteit van de MRI-experimenten kan verder worden verbeterd middels contrastmiddelen (CA). Dit zijn paramagnetische of superparamagnetische soorten die invloed hebben op de longitudinale (T1) en transversale (T2) relaxatie maal respectievelijk 1,2.
Complexen van het lanthanide-ion gadolinium met polyaminozuren polycarbonzuur liganden de meest gebruikte T 1 CA's. Gadolinium (III) verkort de T 1 ontspanningtijd van water protonen, waardoor het signaal contrast in MRI-experimenten 3 toeneemt. Echter, ionische gadolinium giftig; de grootte benadert die van calcium (II), en ernstige gevolgen calcium bijgestaan signalering in cellen. Daarom worden acyclische en macrocyclische chelaten gebruikt om deze toxiciteit te neutraliseren. Verschillende multidentaat liganden zijn tot nu toe ontwikkeld, waardoor gadolinium (III) complexen met een hoge thermodynamische stabiliteit en kinetische inertheid 1. Op basis van het 12-ledige azamacrocycle cyclen, met name het tetracarbonzuur afgeleide DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecaan-1,4,7,10-acetaat) zijn de meest onderzochte en toegepaste complexen van deze CA klasse.
Toch GdDOTA-type CA's zijn lage gewicht systemen moleculair, het weergeven van bepaalde nadelen zoals een lage contrast efficiency en een snelle renale excretie. Macromoleculaire en multivalente CA kan een goede oplossing voor deze problemen 4 zijn. Sinds CA biodistributie wordt vooral bepaald door de grootte, macromoleculaire CA tonen veel langere retentietijden in de weefsels. Even belangrijk is de meerwaardigheid van deze middelen resulteert in een verhoogde lokale concentratie van de monomere MR probe (bijvoorbeeld GdDOTA complex), fundamentele verbetering van de verworven MR-signaal en het meten kwaliteit.
Dendrimeren behoren tot de meest geprefereerde draagstructuren voor de bereiding van meerwaardige CA voor MRI 4,5. Deze sterk vertakte macromoleculen met goed gedefinieerde afmetingen zijn gevoelig voor verschillende koppelingsreacties te binden. In dit werk, melden wij de voorbereiding, zuivering en karakterisering van een dendrimere CA voor MRI, bestaande uit een generatie 4 (G4) poly (amidoamine) (PAMAM) dendrimeer gekoppeld aan GdDOTA-achtige chelaten (DCA). We beschrijven de synthese van de reactieve DOTA-derivaat en de koppeling met de PAMAM dendrimeer. Bij complexering met Gd (III), de standaard fysisch-chemische karakterisering procedure van DCA werd uitgevoerd. Tenslotte werden MRI experimenten uitgevoerd om het vermogen van DCA MR beelden te produceren met een sterker contrast dan die verkregen uit laagmoleculaire CA tonen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voorbereiding van de dendrimere MRI-contrastmiddel vereist juiste keuze van de monomere eenheid (dat wil zeggen, de chelator voor Gd (III)). Ze verminderen de toxiciteit van dit paramagnetische ion en tot nu toe een groot aantal acyclische en macrocyclische chelatoren dienen daartoe 1-3. Hiervan macrocyclische DOTA-type chelatoren bezitten de hoogste thermodynamische stabiliteit en kinetische inertheid en daarmee zijn de meest geprefereerde keuze voor de bereiding van inerte MRI contrastmiddelen <sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The financial support of the Max-Planck Society, the Turkish Ministry of National Education (PhD fellowship to S. G.), and the German Exchange Academic Service (DAAD, PhD fellowship to T. S.) are gratefully acknowledged.
Materials
| Cyclen | CheMatech | C002 | |
| tert-Butyl bromoacetate | Alfa Aesar | A14917 | |
| N,N-Dimethylformamide | Fluka | 40248 | |
| Potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| 4-(4-Nitrophenyl)butryic acid | Aldrich | 335339 | |
| Thionyl chloride | Acros Organics | 382662500 | Note: Corrosive substance; toxic if inhaled |
| Bromine | Acros Organics | 402841000 | Note: causes severe skin burns, fatal if inhaled |
| Diethyl ether | any source | ||
| Sodium sulphate | Acros Organics | 196640010 | |
| Chloroform | VWR Chemicals | 22711.29 | |
| tert-Butyl 2,2,2-trichloroacetimidate | Aldrich | 364789 | Note: flammable substance; irritrant to skin and eyes |
| Boron trifluoride etherate | Acros Organics | 174560250 | 48 % BF3. Note: Flammable substance; causes skin burns, fatal if inhaled |
| Sodium bicarbonate | Acros Organics | 424270010 | |
| Ethyl-acetate | any source | For column chromatography | |
| n-Hexane | any source | For column chromatography | |
| Bulb-to-bulb (Kugelrohr) distillation apparatus | Büchi | Model type: Glass oven B-585 | |
| Silicagel | Carl Roth GmbH | P090.2 | |
| Methanol | any source | For column chromatography | |
| Dichloromethane | any source | For column chromatography | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| Ammonia | Acros Organics | 428381000 | 7N Solution in Methanol |
| Palladium | Aldrich | 643181 | 15 % wet |
| Hydrogenation apparatus PARR | PARR Instrument Company | ||
| Celite 503 | Aldrich | 22151 | |
| Sintered glass funnel | any source | ||
| Thiophosgen | Aldrich | 115150 | Note: irritrant to skin; toxic if inhaled |
| Triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| Dichloromethane | Acros Organics | 348460010 | Extra dry |
| Magnetic stirrer | any source | ||
| PAMAM G4 Dendrimer | Andrews ChemService | AuCS – 297 | 10 % wt. solution in MeOH |
| Lipophylic Sephadex LH-20 | Sigma | LH20100 | |
| Thin-layer chromatography plates | Merck Millipore | 1.05554.0001 | |
| Formic acid | VWR Chemicals | 20318.297 | |
| Lophylizer | any source | ||
| Gadollinium(III) chloride hexahydrate | Aldrich | G7532 | |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 134070010 | |
| pH meter | any source | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Aldrich | E5134 | |
| Mass spectrometer (ESI) | Agilent | Ion trap SL 1100 | |
| Acetate buffer | any source | pH 5.8 | |
| Xylenol orange | Aldrich | 52097 | 20 μM in acetate buffer |
| Hydrophylic Sephadex G-15 | GE Healthcare | 17-0020-01 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Merck Millipore | UFC900324 | Ultracel-3 membrane (MWCO 3000) |
| Centrifuge | any source | ||
| NMR spectrometer | Bruker | Avance III 300 MHz | |
| Topspin | Bruker | version 2.1 | |
| Combustion analysis instrument | EuroVector SpA | EuroEA 3000 Elemental Analyser | |
| MALDI-ToF MS instrument | Applied Biosystems | Voyager-STR | |
| Deuteriumoxid | Carl Roth GmbH | 6672.3 | |
| tert-Butyl alcohol | Carl Roth GmbH | AE16.1 | |
| Vortex mixer | any source | ||
| Norell NMR tubes | Deutero GmbH | 507-HP-7 | |
| NMR coaxial tube | Deutero GmbH | coaxialb-5-7 | |
| DLS instrument | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| 0.20 μm PTFE filter | Carl Roth GmbH | KC94.1 | |
| HEPES | Fisher BioReagents | BP310 | |
| Plastic tube vials | any source | ||
| Dotarem | Guerbet | NDC 67684-2000-1 | |
| MRI scanner | Bruker | BioSpec 70/30 USR magnet (7 T). Note: potential hazards related to high magnetic fields | |
| RF coil | Bruker | dual frequency volume coil (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR) | |
| Paravision (software) | Bruker | Version 5.1 |
References
- Merbach, A. E., Helm, L., Tóth, &. #. 2. 0. 1. ;. . The chemistry of contrast agents in medical magnetic resonance imaging. 2nd ed. , (2013).
- Geraldes, C. F. G. C., Laurent, S. Classification and basic properties of contrast agents for magnetic resonance imaging. Contrast Media Mol. Imaging. 4 (1), 1-23 (2009).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: Structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99 (9), 2293-2352 (1999).
- Villaraza, A. J. L., Bumb, A., Brechbiel, M. W. Macromolecules, Dendrimers, and Nanomaterials in Magnetic Resonance Imaging: The Interplay between Size, Function, and Pharmacokinetics. Chem. Rev. 110 (5), 2921-2959 (2010).
- Langereis, S., Dirksen, A., Hackeng, T. M., van Genderen, M. H. P., Meijer, E. W. Dendrimers and magnetic resonance imaging. New J. Chem. 31 (7), 1152-1160 (2007).
- Gündüz, S., Power, A., Maier, M. E., Logothetis, N. K., Angelovski, G. Synthesis and Characterization of a Biotinylated Multivalent Targeted Contrast Agent. ChemPlusChem. 80 (3), 612-622 (2015).
- Pope, S. J. A., Kenwright, A. M., Heath, S. L., Faulkner, S. Synthesis and luminescence properties of a kinetically stable dinuclear ytterbium complex with differentiated binding sites. Chem. Commun. (13), 1550-1551 (2003).
- Vibhute, S. M., et al. Synthesis and characterization of pH-sensitive, biotinylated MRI contrast agents and their conjugates with avidin. Org. Biomol. Chem. 11 (8), 1294-1305 (2013).
- Vogel, A. I., Furniss, B. S. . Vogel’s textbook of practical organic chemistry. 5th ed. , (1989).
- Lundanes, E., Reubsaet, L., Greibrokk, T. . Chromatography : basic principles, sample preparations and related methods. , (2013).
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).
- Keeler, J. . Understanding NMR spectroscopy. 2nd ed. , (2010).
- Hillenkamp, F., Peter-Katalinić, J. . MALDI MS : a practical guide to instrumentation, methods and applications. , (2007).
- Peters, J. A., Huskens, J., Raber, D. J. Lanthanide induced shifts and relaxation rate enhancements. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 28, 283-350 (1996).
- Averill, D. J., Garcia, J., Siriwardena-Mahanama, B. N., Vithanarachchi, S. M., Allen, M. J. Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (53), e2844 (2011).
- Hagberg, G. E., Scheffler, K. Effect of r1 and r2 relaxivity of gadolinium-based contrast agents on the T1-weighted MR signal at increasing magnetic field strengths. Contrast Media Mol. Imaging. 8 (6), 456-465 (2013).
- Boswell, C. A., et al. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin alpha(v)beta(3)-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharmaceut. 5 (4), 527-539 (2008).
- Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. Primer on Gadolinium Chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).
- Cakić, N., Gündüz, S., Rengarasu, R., Angelovski, G. Synthetic strategies for preparation of cyclen-based MRI contrast agents. Tetrahedron Lett. 56 (6), 759-765 (2015).
- Polasek, M., Hermann, P., Peters, J. A., Geraldes, C. F. G. C., Lukes, I. PAMAM Dendrimers Conjugated with an Uncharged Gadolinium(III) Chelate with a Fast Water Exchange: The Influence of Chelate Charge on Rotational Dynamics. Bioconjugate Chem. 20 (11), 2142-2153 (2009).
- Ali, M. M., et al. Synthesis and relaxometric studies of a dendrimer-based pH-responsive MRI contrast agent. Chem. Eur. J. 14 (24), 7250-7258 (2008).
- Jackson, C. L., et al. Visualization of dendrimer molecules by transmission electron microscopy (TEM): Staining methods and Cryo-TEM of vitrified solutions. Macromolecules. 31 (18), 6259-6265 (1998).
- Jain, K., Kesharwani, P., Gupta, U., Jain, N. K. Dendrimer toxicity: Let’s meet the challenge. Int. J. Pharm. 394 (1-2), 122-142 (2010).
- Rudovsky, J., et al. PAMAM dendrimeric conjugates with a Gd-DOTA phosphinate derivative and their adducts with polyaminoacids: The interplay of global motion, internal rotation, and fast water exchange. Bioconjugate Chem. 17 (4), 975-987 (2006).
- Xu, H., et al. Toward improved syntheses of dendrimer-based magnetic resonance imaging contrast agents: New bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid ligands and nonaqueous conjugation chemistry. J. Med. Chem. 50 (14), 3185-3193 (2007).
- Nwe, K., Bryant, L. H., Brechbiel, M. W. Poly(amidoamine) Dendrimer Based MRI Contrast Agents Exhibiting Enhanced Relaxivities Derived via Metal Preligation Techniques. Bioconjugate Chem. 21 (6), 1014-1017 (2010).
- Livramento, J. B., et al. First in vivo MRI assessment of a self-assembled metallostar compound endowed with a remarkable high field relaxivity. Contrast Media Mol. Imaging. 1 (1), 30-39 (2006).
- Norek, M., Kampert, E., Zeitler, U., Peters, J. A. Tuning of the Size of Dy2O3 Nanoparticles for Optimal Performance as an MRI Contrast Agent. J. Am. Chem. Soc. 130 (15), 5335-5340 (2008).
