Flödescytometrisk analys av Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant helblod
Summary
This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.
Abstract
NK-cell cytotoxicitet är en allmänt använt mått för att bestämma effekten av en yttre intervention på NK-cellfunktion. Emellertid kan exaktheten och reproducerbarheten av denna analys betraktas instabil, antingen på grund av användarens fel eller på grund av känsligheten hos NK-celler till experimentell manipulering. För att eliminera dessa problem, var ett arbetsflöde som reducerar dem till ett minimum etablerad och presenteras här. För att illustrera, erhöll vi blodprover, vid olika tidpunkter, från löpare (n = 4) som lämnades in till en intensiv våg av motion. Först NK-celler samtidigt identifieras och isoleras genom CD56 märkning och magnetisk baserad sortering, direkt från helblod och från så lite som en milliliter. De sorterade NK-celler avlägsnas av något reagens eller kapslings antikroppar. De kan räknas för att fastställa en exakt celltal NK per milliliter blod. För det andra kan de sorterade NK-celler (effekten celler eller e) blandas med 3,3-Diotadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO) märkta K562-celler (målceller eller T) vid en analys optimala 1: 5 T: E-tal, och analyseras med hjälp av en avbildande flödes cytometer som möjliggör visualisering av varje händelse och eliminering av falska positiva eller falskt negativa resultat (såsom dubbletter eller effektorceller). Detta arbetsflöde kan fyllas i cirka fyra timmar, och gör det möjligt att mycket stabila resultat även när man arbetar med prover från människa. När de är tillgängliga, kan forskargrupper testa flera experimentella insatser på människor, och jämföra mätningar över flera tidpunkter utan att kompromissa med datas integritet.
Introduction
Naturliga mördarceller är en viktig del av det medfödda immunförsvaret. Medan de är inte reglerat, de har förmågan att känna igen och eliminera abnorma celler genom cell-till-cell-kontakt och utan föregående aktivering 1. Som sådana utgör de en snabb försvarslinje mot infektioner. Motion, särskilt intensiv, har visat att övergående pressa immunsystemet 2, 3, 4, 5. NK-celler är speciellt benägna att denna effekt 4, 6, 7, i praktiken skapar ett fönster av förstärkt känslighet för sjukdomar. Därför, före, under eller efter intensiv träning med målet att minska sin påverkan på NK cellfunktion är studiet av insatser av särskilt intresse för välbefinnande idrottare post-tävlingar.
<p class= "jove_content"> Emellertid är studien av sådana insatser kompliceras av ett stort antal faktorer: 1) NK-celler är gles 8, vid ca 1% av den vita blodkroppsutrymmet; 2) NK-celler är mycket känsliga för stress och förlita sig på konstant exponering för fysiologiska förhållanden för att förbli livskraftig och stabil under experiment; och 3) standardanalyser för att bestämma NK cell cytotoxicitet, såsom Ficoll-gradienter 9 och släppa analyser 10, är opålitliga och inkonsekventa. Den inneboende variationen i humana prover bara förvärrar dessa frågor. Färska humana prover som tagits under interventioner är tämligen reglerad och svåra att anskaffa, åtminstone i jämförelse med djurprover eller odödliggjorda cellinjer. Detta minskar möjligheterna att upprepa experiment eller lägga till deltagare i studien kohort att nå betydande statistiska trösklar. Tillsammans står dessa frågor stöder behovet av en strömlinjeformad protokoll som gör det möjligt for både hög genomströmning och en hög tillförlitlighetsanalys av NK-cell lytisk aktivitet i prover från människa.Vi etablerade ett arbetsflöde som förkortar den tid som behövs för att identifiera, isolera och testa NK-celler från humant helblod samtidigt minimera exponeringen för yttre faktorer. Metoden optimerar användningen av två instrument, en magnetisk-baserad cellsorterare och en avbildnings flödescytometer, och en analys-specifika, optimerad T: E-förhållandet för att möjliggöra detektion av minskningar eller ökningar av NK-cell cytotoxicitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metod som beskrivs i denna studie mäter direkt den specifika aktiviteten hos en individs NK-celler som svar på stimuli (i detta fall, långvarig träning). Normalt är NK-celler isolerade från ett blod med användning av densitetsgradienter eller cellsortering genom att använda en kombination av markörer. Även om dessa metoder används allmänt, de har många nackdelar: de är tidskrävande, involverar multipla manipulationer, och är kraftigt användarberoende. Som ett resultat, är onödig stress placeras p?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.
Materials
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
References
- Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
- Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, 131-141 (1994).
- Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. Physical activity, immunity and infection. Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).
- Nieman, D. C. Marathon training and immune function. Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).
- Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. Exercise and the Regulation of Immune Functions. Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).
- Walsh, N. P., et al. Position statement. Part one: Immune function and exercise. Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).
- Timmons, B. W., Cieslak, T. Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review. Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).
- Westermann, J., Pabst, R. Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body. Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).
- Boyum, A. Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).
- McMillan, R., Scott, J. L. Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects. Blood. 32 (5), 738-754 (1968).
- Berk, L. S., et al. The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners. Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).
- McAnulty, L. S., et al. Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running. Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).
- Millard, A. L., et al. Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation. Front Immunol. 4, 125 (2013).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , (2001).
