Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana
Summary
This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.
Abstract
la citotoxicidad de células NK es una medida ampliamente utilizada para determinar el efecto de la intervención exterior en función de las células NK. Sin embargo, la precisión y reproducibilidad de este ensayo pueden considerarse inestable, ya sea debido a errores del usuario o debido a la sensibilidad de las células NK a la manipulación experimental. Para eliminar estos problemas, un flujo de trabajo que les reduce al mínimo fue establecido y se presenta aquí. Para ilustrar, se obtuvieron muestras de sangre, en diversos momentos, desde corredores (n = 4) que fueron sometidos a una intensa sesión de ejercicio. En primer lugar, las células NK se identifican de forma simultánea y aislados mediante el etiquetado CD56 y la clasificación basada en magnético, directamente de la sangre entera y de tan poco como un mililitro. Las células NK según se retiran de cualquier anticuerpo reactivo o de tapado. Se puede contar con el fin de establecer un recuento de células NK precisa por mililitro de sangre. En segundo lugar, las células NK según (efectores células o E) se pueden mezclar con 3,3'-Diotadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO) etiquetada células K562 (células diana o T) en un ensayo-óptima 1: 5 T: relación de E, y se analizó usando un citómetro de flujo de imágenes que permite la visualización de cada evento y la eliminación de cualquier falso positivo o falsos negativos (tales como dobletes o células efectoras). Este flujo de trabajo se puede completar en aproximadamente 4 h, y permite obtener resultados muy estables incluso cuando se trabaja con muestras humanas. Cuando esté disponible, los equipos de investigación pueden probar varias intervenciones experimentales en sujetos humanos, y comparar las mediciones a través de varios puntos de tiempo sin poner en peligro la integridad de los datos.
Introduction
Las células asesinas naturales son un elemento esencial del sistema inmune innato. Mientras que están muy regulados, que tienen la capacidad de reconocer y eliminar las células anormales a través del contacto de célula a célula y sin activación previa 1. Como tales, forman una línea rápida de defensa contra las infecciones. El ejercicio, especialmente intenso, se ha demostrado que deprimen de forma transitoria el sistema inmune 2, 3, 4, 5. Las células NK son particularmente propensos a este efecto 4, 6, 7, creando una ventana de aumento de la sensibilidad a la enfermedad. Por lo tanto, el estudio de las intervenciones antes, durante o después del ejercicio intenso, con el objetivo de reducir su impacto sobre la función de las células NK es de particular interés para el bienestar de los atletas después de los concursos.
<p class= "jove_content"> Sin embargo, el estudio de este tipo de intervenciones se complica por varios factores: 1) las células NK son escasos 8, en torno a 1% del compartimiento de glóbulos blancos; 2) Las células NK son muy sensibles al estrés y se basan en la exposición constante a las condiciones fisiológicas para seguir siendo viable y estable durante la experimentación; y 3) ensayos estándar para determinar la citotoxicidad de células NK, tales como gradientes de Ficoll 9 y liberan los ensayos 10, son poco fiables e inconsistente. La variabilidad inherente de las muestras de humanos sólo agravan estos problemas. muestras humanas frescas recogidas durante las intervenciones son bastante regulado y difíciles de conseguir, al menos en comparación con muestras de animales o líneas celulares inmortalizadas. Esto reduce las oportunidades para repetir los experimentos o añadir participantes a la cohorte del estudio para llegar a los umbrales estadísticos significativos. En conjunto, estas cuestiones apoyan la necesidad de un protocolo optimizado que permite for tanto de alto rendimiento y un análisis de alta fiabilidad de la actividad lítica de las células NK en muestras humanas.Hemos establecido un flujo de trabajo que acorta el tiempo necesario para identificar, aislar y células NK prueba de la sangre entera humana y reducir al mínimo la exposición a factores externos. El método optimiza el uso de dos instrumentos, un clasificador basado en magnética celular y un flujo de imágenes citómetro, y un, T optimizado ensayo específico: relación E para permitir la detección de las disminuciones o incrementos de la citotoxicidad de células NK.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito en este estudio mide directamente la actividad específica de las células NK de un individuo en respuesta a estímulos (en este caso particular, el ejercicio prolongado). Típicamente, las células NK están aisladas de la propia sangre usando gradientes de densidad o clasificación de células mediante el uso de una combinación de marcadores. Aunque se utilizan ampliamente estos métodos, que tienen muchos inconvenientes: son mucho tiempo, implican múltiples manipulaciones, y son en gran medida d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.
Materials
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
References
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