A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.
इस तरह के सेल इमेजिंग और दूरदराज के हेरफेर के रूप में कई महत्वपूर्ण जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों, superparamagnetic लोहे के आक्साइड नैनोकणों (SPIONs) के साथ कोशिकाओं लेबलिंग के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। SPIONs की पर्याप्त सेलुलर तेज हासिल करने के लिए एक चुनौती है कि परंपरागत रूप SPIONs की बुलंद सांद्रता के लिए कोशिकाओं को उजागर करके या (72 घंटा तक) जोखिम बार के समय को बढ़ाने से मुलाकात की गई है। हालांकि, इन रणनीतियों विषाक्तता मध्यस्थता की संभावना है। यहाँ, हम एक सतही सतह functionalization प्रोटोकॉल है कि तेजी से सेल संस्कार के लिए सक्षम बनाता कम जोखिम सांद्रता का उपयोग प्रोटीन आधारित SPION magnetoferritin के संश्लेषण के रूप में अच्छी तरह से प्रस्तुत करते हैं। magnetoferritin की SPION कोर 8.2 एनएम mineralized के एक औसत कण व्यास घोड़ा तिल्ली APO-ferritin की गुहा के अंदर के साथ कोबाल्ट डाल दिया गया लोहे के आक्साइड के होते हैं। magnetoferritin का रासायनिक cationization एक उपन्यास, अत्यधिक झिल्ली सक्रिय SPION कि चुम्बकीय मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (hMSCs) के रूप में ऊष्मायन बार का उपयोग कर उत्पादन0.2 मिमी के रूप में चढ़ाव के रूप में एक मिनट और लोहे की सांद्रता के रूप में कम।
भूतल बंधन या superparamagnetic लोहे के आक्साइड नैनोकणों (SPIONs) के internalization ऐसे इमेजिंग और दूरदराज के हेरफेर के रूप में आवेदन के लिए सेल प्रकार की एक किस्म का आकर्षण संस्कार के लिए सक्षम है। 1 हालांकि, पर्याप्त सेलुलर संस्कार को प्राप्त करने के लिए एक चुनौती हो सकती है, खासकर जब SPION और कोशिका की सतह के बीच बातचीत कमजोर है। 2 अतीत, लंबे समय तक निवेश या उच्च सांद्रता SPION में रणनीति इस चुनौती पर काबू पाने के रूप में नियोजित किया गया है। 3,4 फिर भी, इन रणनीतियों क्योंकि वे विषाक्तता 5,6 बढ़ाने के लिए और इस तरह के लिम्फोसाइटों के रूप में कम internalization दरों, साथ प्रकार की कोशिकाओं में बहुत ही सीमित सफलता है समस्याग्रस्त हैं। 7 SPIONs के सेलुलर तेज बढ़ाने के लिए, कई सतह functionalization दृष्टिकोण का पता लगाया गया है। उदाहरण के लिए, एंटीबॉडी रिसेप्टर की मध्यस्थता endocytosis, 8 बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जबकि गैर विशिष्ट तेज अभिकर्मक एक का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकतामर्द 9,10 या ऐसे एचआईवी गूंथना पेप्टाइड के रूप में सेल मर्मज्ञ प्रजातियों। 11,12 हालांकि, एंटीबॉडी और पेप्टाइड functionalization दृष्टिकोण, महंगा अभिकर्मकों और जटिल सिंथेटिक तैयारी द्वारा सीमित अभिकर्मक एजेंटों nanoparticle वर्षा पैदा कर सकते हैं और प्रतिकूल सेल समारोह को प्रभावित है, जबकि रहे हैं। 13,14
हमने हाल ही में रासायनिक cationized magnetoferritin के संश्लेषण, एक उपन्यास SPION (hMSCs) ऊष्मायन बार एक मिनट के रूप में के रूप में कम है जिसके उपयोग से magnetizing मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं में अत्यधिक प्रभावी था की सूचना दी। 15 Magnetoferritin लोहे भंडारण प्रोटीन ferritin के डी-mineralized गुहा के अंदर एक SPION पुनर्गठन द्वारा संश्लेषित है। 16 यह प्रोटीन आधारित SPION कई गुण, जैसे चुंबकीय कोर, 17-19 और biocompatibility और जलीय घुलनशीलता के चुंबकीय गुण प्रोटीन खोल द्वारा प्रदत्त शक्तियों पर नियंत्रण के रूप में यह है कि यह अच्छी तरह से सेल संस्कार के लिए अनुकूल बनाने को जोड़ती है। आगे कीअधिक, सतह functionalization आसानी से पता अमीनो एसिड रासायनिक 20-22 या आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है की वजह से हासिल की है। 23-25 हमें पता चला है कि प्रोटीन के खोल के अम्लीय अमीनो एसिड के अवशेष की रासायनिक cationization एक स्थिर nanoparticle है कि आसानी से कोशिका की सतह तेजी से और लगातार सेल संस्कार के लिए अग्रणी पर ऋणात्मक डोमेन के साथ बातचीत उत्पन्न करता है। यह प्रक्रिया श्रमसाध्य functionalization और लंबी ऊष्मायन प्रोटोकॉल के लिए की आवश्यकता समाप्त, और गैर विशिष्ट लेबलिंग तंत्र की वजह से यह तेजी से आकर्षण संस्कार रणनीति अन्य प्रकार की कोशिकाओं में व्यापक प्रसार आवेदन मिल जाना चाहिए। यहाँ, हम अल्ट्रा फास्ट सेल लेबलिंग विधि की गहराई में रिपोर्ट, cationized magnetoferritin के संश्लेषण, शुद्धि और सतह functionalization की विस्तृत प्रोटोकॉल सहित उपस्थित थे।
aurothioglucose के साथ दाग magnetoferritin नमूने के मंदिर प्रोटीन पिंजरे के अंदर नैनोकणों के सफल खनिज का पता चला। इलेक्ट्रॉन विवर्तन और nanoparticle कोर के रमन विश्लेषण एक कोबाल्ट फेराइट की उपस्थिति का संकेत, कोबाल्ट के साथ nanoparticle कोर के सफल डोपिंग का संकेत है। यह दर्शाता है कि मिश्रित आक्साइड नैनोकणों सफलतापूर्वक APO-ferritin गुहा के भीतर mineralized हो सकता है। इसके अलावा, हम पता चला है कि पहले कि कोबाल्ट डोपिंग प्रतिक्रिया मिश्रण है, जो चुंबकीय गुण की ट्यूनिंग के लिए सक्षम बनाता करने के लिए जोड़ा कोबाल्ट अग्रदूत की राशि बदलकर अलग किया जा सकता है। 18
Magnetoferritin संश्लेषण, के रूप में लंबे समय के रूप में वे कसकर sealable कर रहे हैं और उपयोग बंदरगाहों के माध्यम से जो अभिकारकों की शुरुआत की जा सकती है (जैसे, एक तीन गर्दन दौर नीचे कुप्पी) है वाहिकाओं की एक किस्म में प्रदर्शन किया जा सकता है। प्रतिक्रिया तापमान में पोत रखकर या तो 65 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना चाहिएएक पानी / तेल स्नान या एक डबल तख्ताबंदीवाला पोत का उपयोग कर। यहाँ, हम संश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए एक डबल तख्ताबंदीवाला विद्युत सेल सेटअप इस्तेमाल किया। सफल संश्लेषण की गारंटी करने के लिए, सही पीएच को बनाए रखने और जलीय समाधान की ऑक्सीजन संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। धातु नमक समाधान हमेशा हौसले से अग्रिम में के बजाय का उपयोग करने से पहले तैयार किया जाना चाहिए। इसके अलावा, वाणिज्यिक apoferritin समाधान गुणवत्ता में भिन्न है और संश्लेषण परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं (उदाहरण के लिए।, Nanoparticle कोर mineralized का आकार)। यह निर्माता द्वारा इस्तेमाल के लिए किसी भी अवशिष्ट एजेंट को कम करने को हटाने के लिए 50 मिमी HEPES बफर (पीएच 8.6) संश्लेषण के लिए पूर्व में apoferritin समाधान dialyze करने में मदद कर सकते हैं। यह संश्लेषण के लिए इस्तेमाल APO-ferritin समाधान के बैच नंबर का एक नोट बनाने के लिए उपयोगी है, तो यह विशेष रूप से निर्माता खरीदा जा करने के लिए करना चाहिए अतिरिक्त सामग्री की जरूरत से अनुरोध किया जा सकता है। इसके अलावा, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध APO-ferritin के प्रोटीन एकाग्रता, बोतल पर कहा जाना चाहिए जो कर सकते हैंAPO-ferritin समाधान संश्लेषण के लिए आवश्यक की मात्रा की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। यदि यह मामला नहीं है, इस जानकारी के लिए आपूर्तिकर्ता से संपर्क करें।
धातु लवण और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के क्रमिक अलावा के लाभ – के रूप में यहाँ और पिछली रिपोर्टों में प्रस्तुत है – कि nanoparticle कोर के खनिज कि इस तरह के विभिन्न लोडिंग कारकों (यानी, nanoparticle आकार) प्राप्त किया जा सकता नियंत्रित किया जा सकता है। 33 इसके अलावा, यह आगे एक चुंबकीय जुदाई स्तंभ, जैसे, एक स्तंभ स्टेनलेस स्टील पाउडर एक विद्युत अंदर सुरक्षित के साथ पैक का उपयोग कर magnetoferritin शुद्ध करने के लिए संभव है। 34 इस प्रकार, अत्यधिक monodisperse nanoparticle कोर थोक magnetoferritin नमूना से अलग किया जा सकता है। हालांकि, चुंबकीय सेल लेबलिंग के लिए के रूप में यहाँ प्रस्तुत यह आवश्यक नहीं है। magnetoferritin संश्लेषण की एक सीमा के बारे में 10% की अपेक्षाकृत कम संश्लेषण उपज, और वाणिज्यिक APO-फ़े के अपेक्षाकृत उच्च लागत हैrritin समाधान। हालांकि, ए पी ओ-ferritin भी सस्ते में उपलब्ध घोड़ा तिल्ली स्थापित de-खनिज प्रोटोकॉल का पालन करके ferritin से तैयार किया जा सकता है। 16
(घोड़ा तिल्ली ferritin के अमीनो एसिड अनुक्रम के आधार पर गणना) magnetoferritin की Cationization DMPA के 250 अणुओं और प्रति नकारात्मक आरोप लगाया अवशेषों ईडीसी के 50 अणुओं की एक दाढ़ अनुपात जोड़कर हासिल की थी। प्रोटीन से अधिक अभिकर्मक के इस अतिरिक्त उच्च cationization क्षमता, तुलनीय भी पहले ferritin के cationization के लिए परिणाम की सूचना दी करने में हुई। 35 MALDI-TOF विश्लेषण, apoferritin और cationized apoferritin लिए magnetoferritin कोर के अत्यधिक आणविक जन की वजह से किया गया था। उच्च क्षमता cationization उपज करने के लिए, इष्टतम पीएच भी महत्वपूर्ण है। ईडीसी की मध्यस्थता crosslinking हल्का अम्लीय परिस्थितियों में सबसे अधिक प्रभावी है, और हमने पाया कि पीएच 5 झुकेंगे magnetoferritin के लिए इष्टतम cationization का परिणाम है। हालांकि, अन्य प्रोटीन सी के लिएationization पीएच अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है। पर Cationization या प्रोटीन की समविद्युतविभव बिंदु के करीब है, बचा जाना चाहिए क्योंकि यह गंभीर वर्षा हो सकती है।
cationized magnetoferritin के साथ स्टेम सेल संस्कार अत्यधिक कुशल था और ऊष्मायन बार अच्छी तरह से नीचे 30 मिनट का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। यहां तक कि एक एक मिनट ऊष्मायन 3.6 पीजी, जो प्रभावित करने के लिए एमआरआई के लिए टी 2 और टी 2 * इसके विपरीत आवश्यक सूचना दी सीमा के भीतर है की एक सेलुलर लौह सामग्री में हुई। 36,37 यह भी है कि इस कुशल लेबलिंग कम बाह्य लोहे की सांद्रता के साथ हासिल की है उल्लेखनीय है। उदाहरण के लिए, ऋणात्मक नैनोकणों का उपयोग कर पिछले अध्ययनों 5 मिमी लोहे के साथ एक 30 मिनट ऊष्मायन अवधि के बाद सेल प्रति 10 पीजी के लोहे के स्तर की रिपोर्ट। 38 तुलना में, एक cationized magnetoferritin 0.5 माइक्रोन के प्रोटीन युक्त समाधान के साथ ऊष्मायन लगभग 0.2 मिमी लोहे के साथ ऊष्मायन से मेल खाती है और यह भी सेल प्रति लोहे के लगभग 10 पीजी पैदावार30 मिनट के बाद एल। हम स्पष्ट रूप से मंदिर का उपयोग किसी भी endocytotic पुटिकाओं पहचान करने में सक्षम नहीं थे। हालांकि, cationized ferritin का उपयोग कर पिछले अध्ययनों में पाया गया कि internalization जोखिम के पहले दस मिनट के भीतर हुई। 39,40 Cationized ferritin लेपित पुटिकाओं, clathrin- या caveolin निर्भर endocytosis का संकेत में अनुवादित किया जा सकता है। एक ही अध्ययनों से यह भी खबर दी है कि ऊष्मायन के 30 मिनट के बाद, cationized ferritin अभी भी कोशिका की सतह पर मौजूद है, साथ ही Multivesicular निकायों में लाइसोसोम जैसी थी।
आगे अनुप्रयोगों APO-ferritin पिंजरों में इस तरह के कैंसर रोधी दवाओं 41 या 42 क्वांटम डॉट्स के रूप में अन्य नैनोकणों और / या कार्यात्मक अणुओं के साथ लोड की cationization शामिल हो सकते हैं। इन ferritin निर्माणों की Cationization कोशिकाओं को उनके माल की तेजी से और अधिक कुशल वितरण में हो सकता है।
The authors have nothing to disclose.
This work was financed through the Bristol Centre for Functional Nanomaterials, sponsored by the Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC grant code EP/G036780/1).
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BPE310-1 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis! |
apoferritin from equine spleen | Sigma Aldrich | A3641 | we used LOT# 081M7011V |
cobalt sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
ammonium iron sulphate hexahydrate | Sigma Aldrich | F1543 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
hydrogen peroxide solution (30%) | Sigma Aldrich | 216763 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
sodium citrate | Sigma Aldrich | S1804 | powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months |
Millex GP filter unit, 0.22 micron | Merck Millipore | SLGP033RS | syringe filter |
Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434 | poweder; add to buffers as required |
Centriprep centrifugal filter units | Merck Millipore | 4310 | Ultracel YM-50 membrane, 12 mL volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 mL to 20 mL |
Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis | Merck Millipore | UFC801024 | Ultracel-10 membrane, 4 mL volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 mL to 2 mL |
ANX Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-1287-04 | we packed this column ourselves |
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column | GE Healthcare | 17-1196-01 | this column was bought ready packed |
ÄKTA purifier system | GE Healthcare | 28406264 | |
sample pump P-960 | GE Healthcare | 18-6727-00 | load sample at a flow rate of 10 mL/min |
automated fraction collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | |
Bradford assay reagent | Sigma Aldrich | B6916 | solution ready to use |
Ferritin, Type I: from horse spleen | Sigma Aldrich | F4503 | prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration |
N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) | Sigma Aldrich | 308110 | CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood |
N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E6383 | keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | AppliChem | A0689,0500 | powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5 |
dialysis tubing cellulose membrane | Sigma Aldrich | D9652 | soak 10 min in deionized water before use |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1000 mg/L glucose | Sigma Aldrich | D5546 | warm in 37 °C water bath before use |
fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F7524 | add to stock DMEM bottle, 10 % (v/v) final concentration |
penicillin/streptomycin solution | Sigma Aldrich | P0781 | add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration |
glutamax solution | Gibco | 35050-087 | add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration |
human fibroblast growth factor | PeproTech | 100-18B | add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/mL |
phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | D8537 | sterile solution, for cell cultrue |
trypsin/EDTA solution | Sigma Aldrich | E5134 | keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | powder; make a 2 mM solution in PBS |
bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7030 | add 0.5 % (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter |
MACS multi stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for attachment of MACS magnet |
MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100 % ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches |
MiniMACS separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | can be bought as a starter kit, together with columns and stands |
MACS column pre-separation filter | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | 30 mm filter |
Nitric acid solution, 64-66% | Sigma Aldrich | 7006 | |
Titrando 907, syringe pump | Metrohm | 2.907.0020 | |
Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |||
SpectraMax M5 | Molecular Devices | Used to measure absorbance in the Bradford assay | |
JEM 1200 EX | JEOL | Used for TEM imaging of magnetoferritin | |
InVia Raman spectrometer | Renishaw | Used for Raman spectroscopy | |
Torus DPSS laser | Laser Quantum | Used for Raman spectroscopy | |
Bruker UltrafleXtreme | Applied Biosystems | Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin | |
ZetaSizer Nano-ZS | Malvern Instruments | Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |
Magnetic Property Measurement System | Quantum Design | Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility | |
Magnetom Skyra | Siemens | Used to determine longitudinal and transverse relaxivity | |
Tecnai 12 BioTwin Spirit | FEI | Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin | |
710 ICP-OES | Agilent | Used to determine iron content in cells |