A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.
Mange viktige biomedisinske applikasjoner, for eksempel celle bildebehandling og ekstern manipulasjon, kan oppnås ved å merke celler med superparamagnetiske jernoksid nanopartikler (SPIONs). Oppnå tilstrekkelig cellulært opptak av SPIONs er en utfordring som tradisjonelt har blitt møtt ved å utsette celler til forhøyede konsentrasjoner av SPIONs eller ved å forlenge eksponeringstider (opptil 72 timer). Men disse strategiene er sannsynlig å formidle toksisitet. Her presenterer vi syntesen av protein-baserte Spion magnetoferritin samt en lettvinte overflaten funksjon protokoll som muliggjør rask celle magnetisering ved hjelp av lave eksponeringskonsentrasjoner. Den spion kjerne av magnetoferritin består av kobolt-dopet jernoksyd med en gjennomsnittlig partikkeldiameter på 8,2 nm mineralisert inne i hulrommet av heste milt apo-ferritin. Kjemisk kationisering av magnetoferritin produsert en roman, høyt membran aktiv spion som magnetisert menneskelige stamceller (hMSCs) med inkubasjonstider somkorte som ett minutt og jernkonsentrasjoner som lows som 0,2 mm.
Overflatebinding eller internalisering av superparamagnetiske jernoksid nanopartikler (SPIONs) har gjort det mulig magnetisering av en rekke celletyper for applikasjoner som bildebehandling og ekstern manipulasjon. En imidlertid oppnå tilstrekkelig celle magnetisering kan være en utfordring, spesielt når interaksjonen mellom Spion og celleoverflaten er svak. 2 I de siste, langvarig eksponering eller høy Spion konsentrasjoner har vært ansatt som strategier for å overvinne denne utfordringen. 3,4 Likevel, disse strategiene er problematisk fordi de øker toksisiteten 5,6 og har svært begrenset suksess i celletyper med lave priser internalisering, så som lymfocytter. 7 For å forbedre cellulært opptak av SPIONs, har flere overflatefunksjonalise tilnærminger blitt utforsket. For eksempel har antistoffer blitt anvendt for å fremme reseptormediert endocytose, 8 mens ikke-spesifikt opptak kan oppnås ved hjelp av en transfeksjongents 9,10 eller cellepenetrerende arter, slik som HIV tat-peptid. 11,12 er imidlertid antistoff og peptid funksjonalise tilnærminger begrenset av dyre reagenser og komplekse syntetisk forberedelse, mens transfeksjon agenter kan indusere nanopartikkel nedbør og påvirke cellefunksjon. 13,14
Vi har nylig rapportert syntese av kjemisk kationisert magnetoferritin, en roman spion som var svært effektive i magnetizing menneskelige stamceller (hMSCs) med inkubasjonstider så kort som ett minutt. 15 Magnetoferritin syntetiseres ved rekonstituering av en Spion inne i demineralisert hulrom av jernet lagring proteinet ferritin. 16 Dette proteinbaserte Spion kombinerer mange egenskaper som gjør det godt egnet for celle magnetisering, slik som kontroll av de magnetiske egenskaper av den magnetiske kjerne, 17-19 og biokompatibilitet og vandig oppløselighet er tillagt av proteinet skallet. Lengremer, blir overflatefunksjonalisering lett oppnås på grunn av adresser aminosyrer som kan være kjemisk eller genetisk modifisert 20-22. 23-25 Vi har vist at kjemisk kationisering av de sure aminosyrerestene i proteinet skallet genererer en stabil nanopartikkel som lett interaksjon med anioniske domener på celleoverflaten som fører til rask og vedvarende celle magnetisering. Denne fremgangsmåten eliminerer behovet for arbeidskrevende funksjonalisering og lange inkubasjonstider protokoller, og på grunn av den ikke-spesifikke merking mekanisme dette hurtig magnetisering strategien bør finne utbredt anvendelse i andre celletyper. Her presenterer vi en grundig rapport fra den ultra-raske celle merking metode, inkludert detaljerte protokoller av syntese, rensing og overflaten funksjonalisering av kationisert magnetoferritin.
TEM av magnetoferritin prøver farget med aurothioglucose avslørte vellykket mineralisering av nanopartikler inne i protein buret. Elektrondiffraksjon og Raman analyse av nanopartikkelkjernen indikerte tilstedeværelse av en kobolt ferritt, noe som indikerer vellykket doping av nanopartikkel kjerne med kobolt. Dette viser at mixed-oksid nanopartikler kan med hell være mineralisert innenfor apo-ferritin hulrom. Videre har vi vist tidligere at kobolt doping kan varieres ved å endre mengden av kobolt forløper tilsatt til reaksjonsblandingen, som muliggjør justering av de magnetiske egenskaper. 18
Magnetoferritin syntese kan utføres i en rekke fartøyer, så lenge de er tett lukkbare og har sideåpninger gjennom hvilke reaktantene kan innføres (for eksempel en tre-halset rundbunnet kolbe). Reaksjonstemperaturen bør holdes ved 65 ° C, enten ved å plassere beholderen ien vann / olje-bad eller ved hjelp av en dobbel-mantlet kar. Her har vi brukt en dobbel-mantlet elektrokjemisk celle oppsett for å utføre syntese. For å sikre vellykket syntese, opprettholde den riktige pH-verdi, og å unngå oksygen forurensning av de vandige oppløsninger er avgjørende. Metallsaltoppløsninger bør alltid være forberedt på ferskt før bruk i stedet for på forhånd. Videre kan kommersielle Apoferritin løsninger varierer i kvalitet og påvirker syntese utfall (f.eks., Størrelse på nanopartikkel kjerne mineralisert). Det kan hjelpe til dialyser den Apoferritin løsningen i 50 mM HEPES-buffer (pH 8,6) før syntese for å fjerne eventuelt resterende reduksjonsmiddel som anvendes av produsenten. Det er nyttig å notere batchnummer apo-ferritin løsning som brukes for syntese, så det kan være spesielt bedt om fra produsenten, skal ytterligere materiale må kjøpes. Videre bør proteinkonsentrasjonen av kommersielt tilgjengelige apo-ferritin være angitt på flasken, noe som kanbli brukt til å beregne volumet av apo-ferritin oppløsning som er nødvendig for syntese. Hvis dette ikke er tilfelle, kan du kontakte leverandøren for denne informasjonen.
Fordelen med gradvis tilsetning av metallsalter og hydrogenperoksyd – som presenteres her og i tidligere rapporter – er at mineralisering av nanopartikler kjerne kan kontrolleres slik at ulike belastningsfaktorer (dvs. nanopartikkelstørrelser) kan oppnås. 33 Videre er det mulig å rense magnetoferritin ytterligere ved anvendelse av en magnetisk separasjonskolonne, for eksempel en kolonne fylt med pulver av rustfritt stål festet inne i en elektromagnet. 34 Således kan sterkt monodisperse nanopartikkel kjerner isoleres fra bulk magnetoferritin prøven. Men for magnetisk cellemerking som presenteres her dette er ikke nødvendig. En begrensning av magnetoferritin syntese er den relativt lave syntese utbytte på ca. 10%, og den relativt høye prisen for kommersiell apo-ferritin løsninger. Imidlertid kan apo-ferritin også fremstilles fra billig tilgjengelig heste milt ferritin ved å følge etablerte de-mineraliseringsprotokoller. 16
Kationisering av magnetoferritin ble oppnådd ved tilsetning av et molart forhold på 250 molekyler av DMPA og 50 molekyler av EDC pr negativt ladet rest (beregninger basert på aminosyresekvensen av hest milt ferritin). Dette overskuddet av reagens enn protein resulterte i høye kationisering effektivitet, kan sammenlignes også til tidligere rapporterte resultater for kationisering av ferritin. 35 MALDI-TOF-analyse, Apoferritin og kationisert Apoferritin ble brukt på grunn av overdreven molekylære massen av magnetoferritin kjernen. For å gi høye kationisering effektivitet, er optimal pH også avgjørende. EDC-mediert kryssbinding er mest effektive under svakt sure betingelser, og vi fant ut at pH 5 gitt optimale kationisering resultater for magnetoferritin. Imidlertid, for andre proteiner cationization pH kan trenge å bli optimalisert. Kationisering ved eller nær det isoelektriske punkt av proteinet bør unngås, fordi dette kan føre til alvorlig utfellingen.
Stamcelle magnetisering med kationisert magnetoferritin var svært effektiv og kan oppnås ved bruk av inkubasjonstider godt under 30 minutter. Enda en ett minutts inkubasjon resulterte i et celledelt jerninnhold på 3,6 s, som er innenfor det rapporterte området som er nødvendig for å påvirke T2 og T2 * kontrast for MRI. 36,37 Det er også bemerkelsesverdig at dette effektiv merking er oppnådd med lave ekstracellulære jernkonsentrasjoner. For eksempel, tidligere studier ved hjelp av anioniske nanopartikler rapporterer jernnivåer på 10 pg pr celle etter en 30-minutters inkubasjonstid med 5 mM jern. 38 Til sammenligning inkubering med en kationisert magnetoferritin oppløsning inneholdende 0,5 mM protein tilsvarer inkubasjon med omtrent 0,2 mM jern og gir også omtrent 10 pg jern per cell etter 30 minutter. Vi var ikke i stand til å identifisere eventuelle endocytotic vesikler ved hjelp av TEM. Men tidligere studier med kationisert ferritin fant at intern skjedd i løpet av de første ti minuttene av eksponering. 39,40 kationisert ferritin kan være lokalisert i belagte vesikler, som indikerer clathrin- eller caveolin avhengig endocytose. De samme studier rapporterte også at etter 30 minutters inkubering, kationisert ferritin var fortsatt til stede på celleoverflaten, samt i multivesikulære legemer, ligner lysosomer.
Andre applikasjoner kan inkludere kationisering av apo-ferritin bur lastet med andre nanopartikler og / eller funksjonelle molekyler, slik som anti-kreft narkotika 41 eller kvanteprikker 42. Kationisering av disse ferritin konstruksjonene kan resultere i hurtigere og mer effektiv levering av sin last til celler.
The authors have nothing to disclose.
This work was financed through the Bristol Centre for Functional Nanomaterials, sponsored by the Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC grant code EP/G036780/1).
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BPE310-1 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis! |
apoferritin from equine spleen | Sigma Aldrich | A3641 | we used LOT# 081M7011V |
cobalt sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
ammonium iron sulphate hexahydrate | Sigma Aldrich | F1543 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
hydrogen peroxide solution (30%) | Sigma Aldrich | 216763 | prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis |
sodium citrate | Sigma Aldrich | S1804 | powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months |
Millex GP filter unit, 0.22 micron | Merck Millipore | SLGP033RS | syringe filter |
Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434 | poweder; add to buffers as required |
Centriprep centrifugal filter units | Merck Millipore | 4310 | Ultracel YM-50 membrane, 12 mL volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 mL to 20 mL |
Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis | Merck Millipore | UFC801024 | Ultracel-10 membrane, 4 mL volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 mL to 2 mL |
ANX Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | 17-1287-04 | we packed this column ourselves |
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column | GE Healthcare | 17-1196-01 | this column was bought ready packed |
ÄKTA purifier system | GE Healthcare | 28406264 | |
sample pump P-960 | GE Healthcare | 18-6727-00 | load sample at a flow rate of 10 mL/min |
automated fraction collector Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | |
Bradford assay reagent | Sigma Aldrich | B6916 | solution ready to use |
Ferritin, Type I: from horse spleen | Sigma Aldrich | F4503 | prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration |
N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) | Sigma Aldrich | 308110 | CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood |
N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma Aldrich | E6383 | keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | AppliChem | A0689,0500 | powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5 |
dialysis tubing cellulose membrane | Sigma Aldrich | D9652 | soak 10 min in deionized water before use |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1000 mg/L glucose | Sigma Aldrich | D5546 | warm in 37 °C water bath before use |
fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F7524 | add to stock DMEM bottle, 10 % (v/v) final concentration |
penicillin/streptomycin solution | Sigma Aldrich | P0781 | add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration |
glutamax solution | Gibco | 35050-087 | add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration |
human fibroblast growth factor | PeproTech | 100-18B | add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/mL |
phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | D8537 | sterile solution, for cell cultrue |
trypsin/EDTA solution | Sigma Aldrich | E5134 | keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | powder; make a 2 mM solution in PBS |
bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7030 | add 0.5 % (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter |
MACS multi stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | for attachment of MACS magnet |
MACS MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100 % ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches |
MiniMACS separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | can be bought as a starter kit, together with columns and stands |
MACS column pre-separation filter | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | 30 mm filter |
Nitric acid solution, 64-66% | Sigma Aldrich | 7006 | |
Titrando 907, syringe pump | Metrohm | 2.907.0020 | |
Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |||
SpectraMax M5 | Molecular Devices | Used to measure absorbance in the Bradford assay | |
JEM 1200 EX | JEOL | Used for TEM imaging of magnetoferritin | |
InVia Raman spectrometer | Renishaw | Used for Raman spectroscopy | |
Torus DPSS laser | Laser Quantum | Used for Raman spectroscopy | |
Bruker UltrafleXtreme | Applied Biosystems | Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin | |
ZetaSizer Nano-ZS | Malvern Instruments | Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin | |
Magnetic Property Measurement System | Quantum Design | Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility | |
Magnetom Skyra | Siemens | Used to determine longitudinal and transverse relaxivity | |
Tecnai 12 BioTwin Spirit | FEI | Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin | |
710 ICP-OES | Agilent | Used to determine iron content in cells |