개 동맥과 정맥에서 차 내피 세포의 분리 및 문화
Summary
Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.
Abstract
Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.
Introduction
개는 심혈관 질환의 연구에 큰 동물 모델로서 사용하고 또한 선천적 (유전 적), 혈관 이상 (1, 2)으로 고생 할 수있다. 상업적 내피 세포주 종종 내피 세포 (EC)의 기능을 평가하기 위해 사용되는 이들 질병을 연구. 개를위한 개 대동맥에서 파생 된 (CnAOEC) 가능한 한 상업 내피 세포 라인이있다. 이 세포주는 주로 제어되는 EC 통상 3-5과 같은 연구에 사용된다. 인간 심장 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 내피 세포주 각각 인간 제대 정맥 및 동맥 유래의 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC를) 및 인간 배꼽 동맥 내피 세포 (HUAECs)가있다. HUVECs를 1980 년대 6 이후 혈관 연구의 황금 표준으로 사용되어왔다. 그들은 내피 세포의 기능과 질병 적응을 연구하는 고전적인 모델 시스템으로 간주됩니다. 다른 혈관 내피 세포로부터 분리는 외관 창출 다양전자 및 미세 7 유전 적 배경과 노출로 인한 기능을 제공합니다. 또한, HUVECs를하고 HUAECs은 탯줄에서 조건에 대해 완벽하게 모방 성인 혈관 그들이에 질병에 대응하여 노출되지 않을 수 있습니다 발달 혈관 구조를 유도된다. 따라서, 일반적으로 심혈관 질환에 HUVECs를 발견 결과와 HUAECs을 번역하는 것은 부적절하다.
적응과 성인되는 EC의 행동을 연구 할 때, 관심있는 선박에서 주되는 EC는보다 직접적인 방법으로 사용되어야한다. 이들 세포를 분리하기 위해 여러 가지 방법이보고되어있다. 또한 HUVECs를 위해 사용되는 광범위하게 설명 된 방법은, 효소 적 소화 용액 (8)과 용기를 세척한다. 이것은 종종 평활 근육 세포 및 섬유 아세포 9 비되는 EC의 오염을 초래한다. 분리를위한 또 다른 자주 사용되는 방법은 다음 fluorescence- 다진 혈관 조직의 소화 효소 인분화 (CD) (31) (7, 8). FACS 분류의 내피 세포 마커 클러스터 이후 세포 배양에 기초한 (FACS)를 정렬 활성화 전지 셀의 비교적 대용량을 필요로하며, 따라서 작은 혈관의 내피 세포의 분리에는 적합하지 않다. 우리는 따라서, 고순도의 각종 송곳니 혈관으로부터 순수한 내피 세포 집단을 분리하기위한 새로운 강력한 방법을 개발 목표로. 새로운 분리 방법의 효율성을 테스트하기 위해, 우리는 고립과 크고 작은 여러 개 동맥과 정맥에서 순수한 개 주 내피 세포 (CaPEC) 문화를 획득했습니다. 이 방법은 또한 선천적 인트라 또는 여분 간 문맥 정맥 션트, 개 2에서 일반적인 질환과 같은 질병 및 / 또는 비정상적인 혈관에서 발생하는 내피 세포의 배양을 할 수 있습니다. 용기의 대부분이 남아 INT 이후 방법은 혈관 평활근 세포와 같은 용기의 추가적인 중요한 세포 유형의 분리를 허용절차를 수행하는 동안 역할을합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
송곳니되는 EC에 초점을 맞춘 연구에서 CnAOEC 기본 회선은 개 3, 12, 13의 내피 계통을 모델링하는 데 사용됩니다. 인간의 연구에서, HUVEC 문화는 여전히 황금 표준으로 간주됩니다. 분명히, 탯줄에서 파생되는 EC에 단지 집중하는 것은 심장 혈관 연구에서 확고한 제한입니다. 내피 세포는 동정맥 사양을 결정하는 특정 유전자의 발현 패턴을 갖는다. 생후 혈관 이러한 차이를 고려하기 위해, 우…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Hans de Graaf and Tomas Veenendaal for their technical assistance in culturing the ECs.
Materials
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1X) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
References
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