माउस दिलों में overexpress को rAAV9 की तैयारी या पछाड़ना जीन
Summary
In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.
Abstract
murine मॉडल में आनुवंशिक सामग्री के दौरे वितरण के माध्यम से अभिव्यक्ति या विशिष्ट जीन की गतिविधि को नियंत्रित जीन कार्यों की जांच के लिए परमिट। दिल में उनके चिकित्सीय क्षमता भी निर्धारित किया जा सकता है। वहाँ माउस दिल में इन विवो आणविक हस्तक्षेप के लिए सीमित दृष्टिकोण हैं। संयोजक एडिनो से जुड़े वायरस (rAAV) आधारित जीनोम इंजीनियरिंग में विवो हृदय जीन में गड़बड़ी के लिए एक अनिवार्य उपकरण के रूप में उपयोग किया गया है। इस प्रौद्योगिकी के विशिष्ट लाभ उच्च दक्षता, उच्च विशिष्टता, कम जीनोमिक एकीकरण दर, कम से कम शामिल प्रतिरक्षाजनकता, और कम से कम pathogenicity। यहाँ, के निर्माण के लिए पैकेज, और rAAV9 वैक्टर शुद्ध एक विस्तृत प्रक्रिया में वर्णित है। नवजात पिल्ले में rAAV9 के चमड़े के नीचे इंजेक्शन मजबूत अभिव्यक्ति या माउस दिल में ब्याज की जीन (एस) के कुशल पछाड़ना में परिणाम है, लेकिन जिगर और अन्य ऊतकों में नहीं। हृदय-specifi का प्रयोगग TnnT2 प्रमोटर, दिल में GFP जीन की उच्च अभिव्यक्ति प्राप्त हुई थी। इसके अतिरिक्त, लक्ष्य mRNA दिल में हिचकते किया गया था जब एक rAAV9-U6-shRNA उपयोग किया गया था। वर्किंग rAAV9 प्रौद्योगिकी के ज्ञान के हृदय की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है।
Introduction
को नियंत्रित अभिव्यक्ति या विभिन्न जैविक प्रणालियों में विशिष्ट जीन की गतिविधि जीन समारोह 1 के अध्ययन में एक मूल्यवान रणनीति बन गया है। इस लक्ष्य को पूरा करने का एक सीधा मतलब न्यूक्लियोटाइड दृश्यों में हेरफेर और उत्परिवर्ती alleles उत्पन्न करने के लिए है। हालांकि जीवित कोशिकाओं के जीनोम के लिए सटीक, लक्षित परिवर्तन करने में अभी भी है एक समय लेने वाली और श्रम प्रधान अभ्यास, शक्तिशाली TALEN और Crispr / Cas9 उपकरणों के विकास जीनोम संपादन 2-5 के एक नए युग खोल दिया है। जीन में गड़बड़ी के लिए एक अधिक नियमित प्रयोगशाला विधि आनुवंशिक सामग्री (DNAs और कोडिंग दृश्यों या siRNAs / shRNAs युक्त आरएनए) कोशिकाओं में व्यक्त या ब्याज 1,6 के जीन (ओं) को पछाड़ना की शुरूआत पर ध्यान केंद्रित किया है।
कई मामलों में, जीन में गड़बड़ी के लिए बड़ी अड़चन कोशिकाओं में डीएनए, आरएनए, या प्रोटीन की डिलीवरी है। इन विट्रो अध्ययन के संबंध में, कुशल transfecti के साथसिस्टम पर कई सुसंस्कृत सेल लाइनों में स्थापित किया गया है। हालांकि, विशेष रूप से माउस मॉडल में, इन विवो जीन डिलीवरी अधिक चुनौतीपूर्ण है। वहाँ अतिरिक्त और intracellular बाधाओं को आदेश बहिर्जात अभिकर्मकों के कुशल सेलुलर तेज हासिल करने के लिए नजरअंदाज किए जाने की जरूरत है की एक श्रृंखला रहे हैं। अतिरिक्त बाधाएं तेजी से निकासी और वितरित की सामग्री 7.8 से कम की अवधि शामिल हैं। एक रणनीति के इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए "वाहक" या "वाहन" इन विवो जीन डिलीवरी के लिए के रूप में वायरल वैक्टर का उपयोग करने के लिए है। वायरस के स्वाभाविक रूप से विकसित पारगमन गुण कोशिकाओं 7,9,10 में ब्याज की एक जीन की कुशल वितरण की अनुमति है। वायरल वैक्टर के कई प्रकार विकसित किया है और विभिन्न प्रकार के और अंगों चूहों में कोशिका में विवो जीन हेरफेर में लचीला सक्षम किया गया है।
सबसे अधिक इस्तेमाल किया वायरल सिस्टम Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus, और एडिनो जुड़े वायरस (एएवी) शामिल <s> 11 अप। रेट्रोवायरस एकल असहाय आरएनए वायरस होते हैं और mitotic विभाजन के दौरान एक स्थिर तरीके से मेजबान सेल जीनोम को उनके आनुवंशिक सामग्री पेश कर सकते हैं, लक्ष्य कोशिकाओं और अंगों 12-14 में transduced जीनों की अभिव्यक्ति के लिए आजीवन संभावित प्रदान करते हैं। हालांकि, रेट्रोवायरस के कई प्रकार के केवल संक्रमित कोशिकाओं को विभाजित है, और गैर विभाजित कोशिकाओं में उनकी प्रभावकारिता बहुत कम 15 है। इस जीन डिलीवरी के लिए उनकी उपयोगिता को सीमित करता है। Lentivirus Retroviridae परिवार की एक जीनस है। अन्य रेट्रोवायरस से अलग है, Lentivirus दोनों को विभाजित और गैर विभाजित कोशिकाओं को संक्रमित कर सकते हैं और व्यापक रूप से बाद mitotic और अत्यधिक विभेदित कोशिकाओं 16 में जीन स्थानांतरण के लिए इस्तेमाल किया गया है। Lentivirus के जीवन चक्र भी मेजबान जीनोम में वेक्टर डीएनए के एकीकरण शामिल है। इस प्रकार, Lentivirus की मध्यस्थता जीन डिलीवरी transduced आनुवंशिक तत्वों 16-18 के स्थिर और लंबी अवधि अभिव्यक्ति सक्षम बनाता है। हालांकि, यह सुविधा एक डबल-ए प्रतिनिधित्व कर सकते हैंइन वायरस के उपयोग में dged तलवार जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए, के रूप में वेक्टर डीएनए के एकीकरण इन्सर्शनल म्युटाजेनेसिस को जन्म दे सकती मेजबान कोशिकाओं में और artefactual प्रभाव पैदा कर सकता है। Adenovirus एक और व्यापक रूप से इस्तेमाल जीन वितरण प्रणाली है। रेट्रोवायरस और lentiviruses के विपरीत, एडिनोवायरस गैर एकीकृत कर रहे हैं और मेजबान कोशिकाओं 8,10,11,19 के जीनोमिक ईमानदारी के साथ हस्तक्षेप नहीं करते। इसके अलावा, एडिनोवायरस कई प्रकार की कोशिकाओं में डीएनए transfect कर सकते हैं, और संक्रमण सक्रिय कोशिका विभाजन 19 पर निर्भर नहीं है। एडिनोवायरस की एक और महत्वपूर्ण विशेषता है, वेक्टर शुद्धि में आसानी के रूप में वायरल वैक्टर क्षमता 19,20 दोहराया जाना है। हालांकि, इस प्रणाली का एक प्रमुख चेतावनी है कि Adenovirus संक्रमण विशेष रूप से जीन थेरेपी के अध्ययन में, लक्ष्य कोशिकाओं और अंगों 19 में मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया ट्रिगर, कई जांच में इसके उपयोग को सीमित कर सकते हैं।
इन विभिन्न प्रकार के साथ तुलनावायरल वैक्टर एस, पुनः संयोजक एडिनो जुड़े वायरस (rAAV) आदर्श जीन वितरण प्रणाली 21,22 प्रतीत होता है। यह कम से कम प्रतिरक्षाजनकता और pathogenicity 23,24 दर्शाती है। इसके अलावा, rAAV प्रकार की कोशिकाओं का एक व्यापक रेंज, दोनों विभाजन और गैर विभाजित कोशिकाओं सहित संक्रमित। ज्यादातर मामलों में, rAAV मेजबान जीनोम में एकीकृत नहीं करता है; इस प्रकार, लक्ष्य कोशिकाओं में अवांछित आनुवंशिक या जीनोमिक परिवर्तन के खतरे को कम 22 है।
हाल ही में, rAAV सिस्टम सफलतापूर्वक माउस हृदय की मांसपेशी 23,25-29 में डीएनए एन्कोडिंग प्रोटीन, miRNAs, shRNAs, और Crispr-gRNAs के vivo प्रसव के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस पद्धति हृदय अनुसंधान के क्षेत्र में मौलिक जांच और जीन थेरेपी के अध्ययन में मदद की है। इधर, विस्तृत प्रक्रिया rAAV9 वैक्टर कि कुशलतापूर्वक overexpress या माउस दिलों में ब्याज की जीन पछाड़ना वर्णित किया गया था उत्पन्न करते हैं। प्रोटोकॉल के लिए एक सरल और प्रभावी तरीका प्रदान करता हैmurine प्रयोगात्मक मॉडल में हृदय जीन अभिव्यक्ति जोड़ तोड़।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्लाज्मिड निर्माण के दौरान अवांछित आईटीआर पुनर्संयोजन कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। वायरस पैदा करने से पहले, एक हमेशा प्रतिबंध पाचन और agarose जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके एएवी plasmids के आईटीआर अखंडत?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).
Materials
| Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) | Polysciences, Inc. | #23966-2 | |
| Tube, Polypropylene, 36.2 mL, 25 x 87 mm, (qty. 56) | Beckman Coulter, Inc | # 362183 | |
| Nuclease, ultrapure | SIGMA | #E8263-25KU | |
| Density Gradient Medium(Iodixanol) | SIGMA | #D1556-250ML | |
| Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD Millipore Corporation | #UFC910008 | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub | SIGMA | #CAD7942-12EA | |
| Poloxamer 188 solution (Pluronic® F-68 solution) | SIGMA | P5556-100ML | |
| Proteinase K | SIGMA | 3115828001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| DMEM medium | Fisher Scientific | SH30243FS | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| rAAV9 vector | Penn Vector Core | P1967 |
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