Forberedelse av rAAV9 å overuttrykker eller Knockdown Gener i Muse Hjerter
Summary
In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.
Abstract
Regulering av ekspresjonen eller aktiviteten av spesifikke gener gjennom myokardialt levering av genetisk materiale i murine modeller tillater undersøkelse av genfunksjoner. Deres terapeutiske potensial i hjertet kan også bestemmes. Det er begrenset tilnærminger for in vivo molekylær intervensjon i mus hjerte. Rekombinant adeno-assosiert virus (rAAV) -basert genom engineering har blitt brukt som et viktig verktøy for in vivo hjerte genmanipulering. De spesifikke fordelene med denne teknologien har høy effektivitet, høy spesifisitet, lav genomisk integrasjon hastighet, minimal immunogenisitet, og minimal patogenitet. Her er en detaljert fremgangsmåte for å konstruere, pakke, og rense rAAV9 vektorer beskrevet. Subkutan injeksjon av rAAV9 inn i neonatale unger resulterer i sterk ekspresjon eller effektiv knockdown av genet (er) av interesse i mus hjertet, men ikke i leveren og andre vev. Bruk av hjerte-spesific TnnT2 promoter, høy ekspresjon av GFP-genet i hjertet ble oppnådd. I tillegg målrette mRNA ble hemmet i hjertet når en rAAV9-U6-shRNA ble benyttet. Kjennskap til rAAV9 teknologi kan være nyttig for kardiovaskulære undersøkelser.
Introduction
Kontrollere ekspresjonen eller aktiviteten av spesifikke gener i forskjellige biologiske systemer har blitt en verdifull strategi i studier av genfunksjon 1. En direkte måte å oppnå dette målet er å manipulere nukleotidsekvenser og generere mutante alleler. Selv om å lage nøyaktige, målrettet endres til genomet av levende celler er fremdeles en tidkrevende og arbeidskrevende praksis, har utviklingen av de kraftige Talen og Crispr / Cas9 verktøy åpnet en ny æra av genom redigering 2-5. En mer rutinemessig laboratoriemetode for genmanipulering har fokusert på innføring av genetisk materiale (DNA-er og RNA-er inneholdende kodende sekvenser eller sirnas / shRNAs) inn i cellene for å uttrykke eller knockdown genet (r) av interesse 1,6.
I mange tilfeller er det vesentlig flaskehals for genmanipulering er levering av DNA, RNA eller protein inn i cellene. Med hensyn til in vitro-studier effektiv transfectipå systemer har vært etablert i mange dyrkede cellelinjer. Men i musemodellen i særdeleshet, er in vivo genavlevering mer utfordrende. Det finnes en rekke ekstra- og intracellulære hindringer som må omgås for å oppnå effektiv cellulært opptak av de eksogene reagenser. Andre hindringer inkluderer rask rydding og den korte varigheten av den leverte materialer 7,8. En strategi for å omgå disse problemene er å bruke virale vektorer som "bærere" eller "kjøretøy" for in vivo genet levering. De naturlig utviklede transduksjon egenskaper av virus tillater effektiv levering av et gen av interesse til cellene 7,9,10. Tallrike typer av virale vektorer er blitt utviklet og muliggjør fleksibel in vivo genmanipulering i forskjellige celletyper og organer hos mus.
Den mest vanlig brukte virale systemer omfatter Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus, og adenoassosiert virus (AAV) <sopp> 11. Retrovirus er enkelt-trådet RNA-virus og kan innføre deres genetiske materiale til vertscellegenomet på en stabil måte i løpet av mitotisk deling, og gir potensial for livsvarig ekspresjon av de transduserte gener i målcellene og organer 12-14. Men mange typer av retrovirus bare infisere delende celler, og deres effekt i ikke-delende celler er meget lav 15. Dette begrenser deres nytte for genet levering. Lentivirus er en slekt av den Retroviridae familien. Forskjellig fra andre retrovirus, kan Lentivirus infisere både dele og ikke-delende celler og har vært mye brukt for genoverføring inn i post-mitotisk og høyt differensierte celler 16. Livssyklusen til Lentivirus innebærer også integrasjon av vektor-DNA i vertsgenomet. Således Lentivirus-genavlevering muliggjør stabil og lang varighet ekspresjon av de transduserte genetiske elementer 16-18. Imidlertid kan denne funksjonen representerer en dobbel-edged sverd i bruken av disse virus for å manipulere genekspresjon, som integrering av vektor DNA kan føre til insertional mutagenese i vertscellene og kan føre til gjenstands effekter. Adenovirus er en annen mye brukt genavleveringssystem. I motsetning til retrovirus og lentivirus, adenovirus er ikke-integrert og forstyrrer ikke den genomiske integriteten av vertsceller 8,10,11,19. I tillegg kan adenovirus transfektere DNA inn i mange celletyper, og infeksjon er ikke avhengig av aktiv celledeling 19. En annen viktig egenskap av adenovirus er den enkle vektor rensing, så de virale vektorene har evnen til å bli replikert 19,20. Imidlertid, den store forbeholdet ved dette system er at adenovirus-infeksjon kan utløse sterke immunresponser hos målceller og organer 19, som begrenser dens anvendelse i mange undersøkelser, spesielt i genterapi studier.
Sammenlignet med disse ulike types av virale vektorer, rekombinant Adeno-assosiert virus (rAAV) synes å være den ideelle genavleveringssystemet 21,22. Det viser minimal immunogenisitet og patogenitet 23,24. I tillegg rAAV infiserer et bredt spekter av celletyper, inkludert både delende og ikke-delende celler. I de fleste tilfeller betyr rAAV ikke integreres i verts genomer; således er risikoen for uønskede genetiske eller genomiske forandringer i målcellene er lav 22.
Nylig har rAAV systemer blitt brukt for in vivo levering av DNA som koder for proteiner, mirnas, shRNAs, og Crispr-gRNAs inn mus hjertemuskelen 23,25-29. Denne metodikken har tilrettelagt grunnleggende undersøkelser og genterapistudier innen kardiovaskulær forskning. Her, til detaljert prosedyre generere rAAV9 vektorer som effektivt overuttrykker eller knockdown gener av interesse i mus hjerter ble beskrevet. Protokollen tilveiebringer en enkel og effektiv metode formanipulere kardial genekspresjon i murine eksperimentelle modeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er viktig å minimere uønsket ITR rekombinasjon i løpet av plasmid konstruksjon. Før generering av viruset, må man alltid overvåke ITR integriteten av AAV plasmider ved hjelp av restriksjons spaltning og agarose gelelektroforese. Det er umulig å oppnå 100% intakte plasmidene, men den rekombinasjon forholdet bør minimaliseres så mye som mulig. Mindre enn 20% er akseptabelt for vellykket rAAV9 emballasje. Av notatet, kan dyrking bakterier ved lavere temperatur (30 ° C) med en lavere ristehastigheten (180-200…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).
Materials
| Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) | Polysciences, Inc. | #23966-2 | |
| Tube, Polypropylene, 36.2 mL, 25 x 87 mm, (qty. 56) | Beckman Coulter, Inc | # 362183 | |
| Nuclease, ultrapure | SIGMA | #E8263-25KU | |
| Density Gradient Medium(Iodixanol) | SIGMA | #D1556-250ML | |
| Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD Millipore Corporation | #UFC910008 | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub | SIGMA | #CAD7942-12EA | |
| Poloxamer 188 solution (Pluronic® F-68 solution) | SIGMA | P5556-100ML | |
| Proteinase K | SIGMA | 3115828001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| DMEM medium | Fisher Scientific | SH30243FS | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| rAAV9 vector | Penn Vector Core | P1967 |
References
- Primrose, S. B., Twyman, R. . Principles of gene manipulation and genomics. , (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Szulc, J., Wiznerowicz, M., Sauvain, M. -. O., Trono, D., Aebischer, P. A versatile tool for conditional gene expression and knockdown. Nat. Methods. 3, 109-116 (2006).
- Nimesh, S., Halappanavar, S., Kaushik, N. K., Kumar, P. Advances in Gene Delivery Systems. BioMed Res. Int. 2015, 610342 (2015).
- Kamimura, K., Suda, T., Zhang, G., Liu, D. Advances in gene delivery systems. Pharm. Med. 25, 293-306 (2011).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
- Giacca, M., Zacchigna, S. Virus-mediated gene delivery for human gene therapy. J. Control Release. 161, 377-388 (2012).
- Witlox, M., Lamfers, M., Wuisman, P., Curiel, D., Siegal, G. Evolving gene therapy approaches for osteosarcoma using viral vectors: review. Bone. 40, 797-812 (2007).
- De Miguel, M. P., Cheng, L., Holland, E. C., Federspiel, M. J., Donovan, P. J. Dissection of the c-Kit signaling pathway in mouse primordial germ cells by retroviral-mediated gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 10458-10463 (2002).
- Nagano, M., Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells. FEBS Lett. 475, 7-10 (2000).
- Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 4626-4630 (1991).
- Katz, R. A., Greger, J. G., Skalka, A. M. Effects of cell cycle status on early events in retroviral replication. J. Cell. Biochem. 94, 880-889 (2005).
- Escors, D., Breckpot, K. Lentiviral vectors in gene therapy: their current status and future potential. Arch. Immunol. Ther. Exp. 58, 107-119 (2010).
- Mátrai, J., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Recent advances in lentiviral vector development and applications. Mol. Ther. 18, 477-490 (2010).
- Miyazaki, Y., Miyake, A., Nomaguchi, M., Adachi, A. Structural dynamics of retroviral genome and the packaging. Front. Microbiol. 2, 1-9 (2011).
- Douglas, J. T. Adenovirus-Mediated Gene Delivery. Gene Delivery to Mammalian Cells: Volume 2: Viral Gene Transfer Techniques. , 3-14 (2004).
- Armendáriz-Borunda, J., et al. Production of first generation adenoviral vectors for preclinical protocols: amplification, purification and functional titration. J. Biosci. Bioeng. 112, 415-421 (2011).
- Snyder, R. O. Adeno-associated virus-mediated gene delivery. J Gene Med. 1, 166-175 (1999).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene transfer in porcine myocardium after coronary infusion of an adeno-associated virus vector. Ann. Thorac. Surg. 62, 1669-1676 (1996).
- Kaspar, B. K., et al. Myocardial gene transfer and long-term expression following intracoronary delivery of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 7, 316-324 (2005).
- Ding, J., et al. Trbp regulates heart function through microRNA-mediated Sox6 repression. Nat. Genet. 47, 776-783 (2015).
- Lin, Z., et al. Cardiac-specific YAP activation improves cardiac function and survival in an experimental murine MI model. Circ. Res. 115, 354-363 (2014).
- Wahlquist, C., et al. Inhibition of miR-25 improves cardiac contractility in the failing heart. Nature. 508, 531-535 (2014).
- Carroll, K. J., et al. A mouse model for adult cardiac-specific gene deletion with CRISPR/Cas9. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, 338-343 (2016).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342, 111-114 (2013).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).
- Rychlik, W., Spencer, W., Rhoads, R. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).
- Allocca, M., et al. Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice. J. Clin. Invest. 118, 1955-1964 (2008).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol. Ther. 18, 80-86 (2010).
- Li, J., Sun, W., Wang, B., Xiao, X., Liu, X. -. Q. Protein trans-splicing as a means for viral vector-mediated in vivo gene therapy. Hum. Gene Ther. 19, 958-964 (2008).
- Piras, B. A., O’Connor, D. M., French, B. A. Systemic delivery of shRNA by AAV9 provides highly efficient knockdown of ubiquitously expressed GFP in mouse heart, but not liver. PLoS One. 8, e75894 (2013).
- Lovric, J., et al. Terminal differentiation of cardiac and skeletal myocytes induces permissivity to AAV transduction by relieving inhibition imposed by DNA damage response proteins. Mol. Ther. 20, 2087-2097 (2012).
