Este manuscrito describe cómo la pantalla para termoestabilizante mutaciones, purificar el transportador de serotonina humano, generar anticuerpos de alta afinidad, y cristalizar el complejo transportador de serotonina-anticuerpo unido a la antidepresivo fármaco S citalopram. Este protocolo puede ser adaptado para el estudio de otros transportadores desafiantes de membrana, receptores y canales.
El transportador de la serotonina es un transportador de sodio y cloruro de acoplamiento de que "bombea" serotonina extracelular en las células. S citalopram es un fármaco utilizado para tratar la depresión y la ansiedad mediante la unión al transportador de serotonina con alta afinidad, el bloqueo de la recaptación de serotonina. Aquí mostramos un procedimiento eficaz y un conjunto de herramientas para estabilizar, expreso, purificar y cristalizar complejos transportador de serotonina-anticuerpo unidos a S citalopram y otros antidepresivos. Las mutaciones que estabilizan el transportador de serotonina se identificaron utilizando un ensayo de unión citalopram S. Transportador de la serotonina expresada en baculovirus transducidas HEK293s GnTI – células, se reconstituyó en proteoliposomas y se utiliza para generar anticuerpos de alta afinidad. Hemos desarrollado una estrategia para descubrir anticuerpos que son útiles para estudios estructurales. También se ha establecido un enfoque directo para la expresión de fragmentos de anticuerpos en células Sf9.Transporter complejos de anticuerpos purificados mediante este procedimiento se comportan bien y fácilmente cristalizan, la producción de complejos con S citalopram que difractan los rayos X para 3-4 Å de resolución. Las estrategias desarrolladas aquí pueden ser utilizados para determinar la estructura de otras proteínas de membrana desafiantes.
El transportador de serotonina (SERT) es una proteína integral de membrana que facilita el transporte de la serotonina a través de membranas celulares 1. SERT pertenece a una familia de neurotransmisor de sodio symporters (ENA), que también incluye la dopamina y la norepinefrina 2 transportadores. SERT es la diana molecular de los fármacos antidepresivos y contra la ansiedad ampliamente prescritos que actúan para inhibir competitivamente transporte de serotonina 3. SERT explota el cotransporte energéticamente favorable de sodio para eliminar el neurotransmisor de la hendidura sináptica. Amplia caracterización del sistema serotoninérgico ha demostrado que los cambios en el metabolismo de la serotonina parecen influir en prácticamente todos los procesos neurológicos, incluyendo el estado de ánimo, el sueño, el dolor, la cognición y la agresión comportamientos 4. Función de SERT puede modificarse mediante el uso de antidepresivos y los inhibidores de la recaptación selectiva de serotonina (ISRS) como citalopram S, así como por psychostimulaNTS y drogas adictivas como la anfetamina y -methylamphetamine 3,4-methylenedioxy- N o "éxtasis" 1,2.
ISRS son tremendamente importante para el tratamiento de los trastornos del estado de ánimo, sin embargo, precisamente la base estructural para su acción no se entiende bien. WT SERT es inestable en micelas de detergente, impidiendo así el progreso hacia una estructura tridimensional (3D) de SERT 5,6. Recientemente, hemos desarrollado variantes de SERT que son robustamente estable en una amplia gama de detergentes y retienen la actividad de unión a 6 SSRI. Estas variantes de SERT termoestables fueron seleccionados utilizando un ensayo de termoestabilidad basado en proximidad de centelleo. Aquí se describe un procedimiento para la generación de anticuerpos de alta afinidad que pueden unirse SERT, y la purificación y cristalización de SERT termoestable, en el complejo con anticuerpo y S citalopram.
Este protocolo supone que el SERT y 8B6 genes han sido exitosoy se clonó en los vectores de BacMam 7 e insecto de expresión, respectivamente. Para generar anticuerpos, ADNc que codifican los residuos 73-616 de WT SERT se clonó en el vector BacMam con una etiqueta C-terminal Strep II (SERT IC). Para la pantalla termoestabilidad, se utilizaron residuos de SERT 73-616 con GFP C-terminal, Strep II, y 10-His (TC SERT). Mutaciones puntuales individuales se generaron en el fondo SERT TC. Para el protocolo de cristalización, la proteína de fusión SERT-GFP se utiliza con Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] y 10 Sus etiquetas, llevando los mutantes termoestables, Y110A, I291A, y T439S y mutaciones de cisteínas superficie C554A, C580A y C622A (CC SERT). Secuencias de escisión de trombina (LVPRGS) también se insertaron en el CC SERT después de Q76 y T618 para permitir la retirada de los extremos N- y C-terminales. El plásmido que codifica el Fab 8B6 fue diseñado para expresar tanto la cadena pesada y ligeracadenas del anticuerpo con secuencias de secreción de gp67 bajo el control de dos promotores de polihedrina separadas. El C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo 8B6 fue etiquetado con un 8-His tag y se insertó un sitio de escisión de trombina entre la cadena pesada y la etiqueta.
Determinación de la estructura de la proteína de membrana mediante técnicas biofísicas sigue siendo una tarea de enormes proporciones para muchos transportadores médicamente significativos, receptores y canales 11. Aquí compartimos conocimientos detallados desarrollado para la determinación de la estructura del transportador de serotonina humana unida a S citalopram. Anticipamos que estos métodos serán útiles para determinar estructuras de SERT en otros estados conformacionales, así como estructuras de otras proteínas de la membrana difíciles. Además, las técnicas bioquímicas descritas aquí también se pueden utilizar para la función de SERT purificada en detergente y un entorno de lípidos casi nativo estudiar.
SERT cristalización con bisagras en el desarrollo de varios instrumentos y técnicas. En primer lugar, la mejora de la termoestabilidad transportador producen variantes de SERT que se comportan bien en varias micelas de detergente después de la extracción del transportador de las membranas 6. En segundo lugar, el usode la alta afinidad de ligando S citalopram a lo largo de la purificación y cristalización mejora adicionalmente la estabilidad y la reducción de la heterogeneidad conformacional. En tercer lugar, el desarrollo del sistema de expresión BacMam 7 permitido para la producción de grandes cantidades de SERT en un corto período de 2 semanas, lo que facilita tanto la inmunización y cristalización. Por último, el desarrollo de estrategias para seleccionar los anticuerpos de alta afinidad que reconocen epítopos 3D permitidos para el descubrimiento del anticuerpo 8B6 que promueve el embalaje bien ordenada de los complejos de SERT-anticuerpo en cristales.
Hay una serie de pasos críticos y los reactivos, así como problemas comunes que a menudo se producen en todo el protocolo. En primer lugar, la generación de alto título de virus SERT P2 puede ser problemático. La adición de bajas concentraciones de virus P1 para generar virus P2 como se describe en este protocolo por lo general mitiga este problema, y en casos en que el título de virus P2 es baja, virus P3 se puede hacer usinG del virus a una MOI de 0,0001. Los virus con un título de menos de 1 x 10 8 partículas de virus / mL no se deben utilizar y casi siempre como resultado rendimientos de proteínas bajas. Para la expresión, HEK293s GnTI – se eligieron las células ya que carecen de N -acetylglucosaminyltransferase I actividad y por lo tanto no pueden sintetizar complejos -glycans N, en lugar produciendo sólo de alta manosa N -glycans. Escinde EndoH N -ligada glicosilación de alta manosa glicanos en dos sitios en bucle extracelular 2 (EL2), dejando un acetilglucosamina N unido a asparagina. La digestión de N -vinculada azúcares reduce la entropía superficie de EL2 que probablemente importante para la cristalización. Para la generación de anticuerpos, el SERT IC se debe utilizar para la inmunización. GFP es altamente inmunogénica 12 y no debe ser utilizado como un marcador de fusión para generar anticuerpos, ya que es difícil eliminar completamente por SEC. también El N- flexible y C-terminal de SERT no eranincluido en el constructo con el fin de evitar los anticuerpos contra estas regiones. Los ratones pueden inmunizarse con 30 g de proteína reconstituida; continuar ratones inmunizantes hasta altas concentraciones en suero de anticuerpos se pueden detectar y producir células de hibridoma como se describe 13. Una construcción termoestabilizada suele ser la mejor opción para la inmunización; si el transportista se comporta bien y retiene la actividad biológica después de la purificación, esto es a menudo suficiente para generar anticuerpos. El anticuerpo 8B6 se planteó en contra WT SERT. Para la cristalización, sólo las fracciones de los picos de SEC que contienen complejo monodisperso como se juzga por FSEC deben ser combinados y se concentraron. cristales SERT-8B6 crecen en un estrecho rango de condiciones y hay una serie de pasos que se deben tomar para solucionar problemas relacionados específicamente con el crecimiento de cristales SERT. Tris base ajustado con HCl no se debe utilizar en la solución de depósito, ya que este tampón no soporta el crecimiento de cristales; por lo que es critical para usar en lugar Tris ajustado con NaOH. cristales de SERT crecen en un estrecho rango de concentraciones de PEG 400, por lo que si los cristales no crecen o si se observan muchos cristales pequeños, se aconseja incluso un pequeño aumento o disminución en la concentración de PEG 400. Además, también se utilizó el ácido aditivo 6-aminohexanoico en la pantalla optimizado para mejorar la nucleación. La relación gota de proteínas: solución bien es también un factor determinante para el crecimiento de los cristales. Caída de proporciones de 1,5 a 2: 1 se recomienda, con relaciones de gota más cerca de 2: 1 típicamente apoyar el crecimiento de cristales de 3 dimensiones más grandes. Finalmente, el uso de perfil bajo placas de 24 pocillos también es crucial para el crecimiento de cristales, presumiblemente debido a la modificación de la velocidad de difusión de vapor.
Un enfoque alternativo para el método de SPA ha sido desarrollado para la detección de mutantes que estabilizan el transportador de serotonina de rata en una conformación de cocaína unida usando un filtro de ensayo 5 de unión. Por el contrario, los BA SPAensayo sed permite etapas de calentamiento secuenciales siguientes mediante la determinación de la fracción de SERT que permanece unida a ligando. Por lo tanto, esto permite la determinación rápida de la temperatura de fusión de un pequeño número de muestras. El método de SPA se basa en la disponibilidad de un ligando de alta afinidad radiomarcado y si no se conocen ligandos que se unen con afinidad submicromolar entonces será necesario un enfoque alternativo. Muchos otros métodos se utilizan comúnmente para medir la estabilidad de proteínas tal como la unión de colorantes fluorescentes y calorimetría 14 pero son de bajo rendimiento y son incapaces de medir directamente la función o requerir grandes cantidades de proteína. Si no se puede utilizar el método de SPA, un enfoque de alto rendimiento alternativa es un ensayo basado en FSEC termoestabilidad 15 (FSEC-TS), donde la muestra se calienta seguido de separación de la fracción de transportador restante. FSEC-TS es un enfoque útil para acceder comportamiento cromatográfico y el estado oligomérico y es apowerful herramienta complementaria que puede ser utilizado junto con el método de SPA.
También se encontró una comparación de diversos sistemas de expresión de proteínas comunes a favorecer el uso de células de mamífero para la expresión SERT 16 y como era de esperar este es probablemente el caso de muchas proteínas de origen mamífero. Los métodos que hemos utilizado para la expresión se han adaptado para SERT pero es probable fácilmente adaptable. Las condiciones que favorecen altos niveles de expresión deben ser cuidadosamente identificados por la variación del tiempo de la expresión, la temperatura, la concentración de virus, y la presencia de inhibidores de la histona desacetilasa tales como butirato de sodio.
Por lo general, a favor de la purificación por afinidad en un detergente de cadena larga suave tal como C12M junto con CHS antes de la reconstitución para retener de unión a ligando de alta afinidad. La reconstitución usando absorción hidrófobo es una técnica suave que hemos encontrado para ser eficaz para varios otros transportadores y receptores. Si estono tiene éxito, la eliminación de los detergentes con altas concentraciones micelares críticas mediante diálisis, dilución, o SEC se puede emplear 17 proporcionan el antígeno es suficientemente estable en tales detergentes. En los casos en que no se detectan anticuerpos adecuados, nos encontramos casi siempre el problema es debido a la pérdida de la función o desnaturalización del antígeno y en tales casos se realizó con éxito nuevas vacunas prestando especial atención a la bioquímica de proteínas. Finalmente, ligandos y anticuerpos que se unen con alta afinidad deben constituir la base para un experimento de cristalización racionalmente planificada y mediante el aprovechamiento de una variante termoestable, se puede seleccionar una gama más amplia de condiciones mediante la variación de las propiedades de diferentes detergentes. Además, la cristalización en una mesofase lipídica 18 o el uso de bicelas 19 siempre deben ser considerados como una alternativa a la cristalización en micelas.
Estos principios y métodos se pueden utilizar con un poco de modificación para muchas otras proteínas transmembrana que son difíciles de expresar y purificar a partir de otros huéspedes de expresión, y que será particularmente útil para la determinación de la estructura de los objetivos de los medicamentos de alta afinidad.
The authors have nothing to disclose.
We thank D. Cawley for generating monoclonal antibodies. We thank A. Penmatsa and K. Wang for sharing ideas and expertise developed from the dopamine transporter. L. Vaskalis for assistance with figures, H. Owen for help with manuscript preparation and other Gouaux laboratory members for helpful discussions. J.A.C. has support from a Banting postdoctoral fellowship from the Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. is supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship. We are particularly grateful to Bernie and Jennifer LaCroute for their generous support, as well as for funding from the NIH (5R37MH070039). E.G. is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.
DH10Bac | Invitrogen | 10361-012 | |
Kanamycin | Fisher | BP906-5 | |
Gentamicin | Fisher | BP918-1 | |
Tetracycline | Sigma | T-7660 | |
Bluo-gal | Invitrogen | 15519-028 | 5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside |
IPTG | Anatrace | I1003 | |
Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
Cellfectin II | Invitrogen | 10362-100 | Sf9 transfection reagent |
SF9 | ATCC | CRL-1711 | |
Sf-900 III SFM media | Life Technologies | 12658-027 | |
HEK-293S GnTI- | ATCC | CRL-3022 | |
Freestyle 293 media | Life Technologies | 12338-018 | 293 expression media |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 0984018DJ | |
Sodium butyrate | Sigma | 303410 | |
S-citalopram | Sigma | E4786 | Anagrade |
n-Dodecyl-?-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
Cholesteryl hemmisuccinate | Sigma | C6013 | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457P | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757P | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol | Avanti Polar Lipids | 840457P | |
Leupeptin | Sigma | L2884 | |
Pepstatin A | Sigma | P5318 | |
Aprotinin | Sigma | A1153 | |
PMSF | Sigma | P7626 | |
Desthiobiotin | Iba Life Sciences | 2-1000-05 | |
Asolectin | Sigma | 11145 | |
Cholesterol | Sigma | C-8667 | |
Lipid A | Sigma | L5399 | |
Brain polar lipid | Avanti Polar Lipids | 141101C | |
Biobeads | Biorad | 152-3920 | Hydrophobic absorption resin |
Goat anti-mouse IRDye 680RD | Odyssey | 926-68070 | Used as secondary for western blotting |
Lauryl maltose neopentyl glycol | Anatrace | NG310 | Anagrade |
Serotonin | Sigma | H9523 | |
pFastBac 8B6 | Available from authors | ||
pEG Bacmam SERT Strep II | SERTIC, Available from authors | ||
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His | SERTTC, Available from authors | ||
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His | SERTCC, Available from authors | ||
Imidazole | Sigma | 56749 | |
n-Octyl β-D-maltoside | Anatrace | O310 | Anagrade |
Thrombin | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
EndoH | New England Biolabs | P0702 | |
Trizma-HCl | Sigma | T5941 | Tris used for preparation of crystallization reservoirs |
PEG 400 | Sigma | 91893 | |
6-aminohexanoic acid | Sigma | 7260 | |
Trypsin-EDTA | Fisher | MT25052CV | |
Isoplate-96 TC | PerkinElmer | 6005070 | |
PolyJet | SignaGen | SL100688 | Polymer transfection reagent for mamalian cells |
Copper HIS-Tag YSI SPA Beads | PerkinElmer | RPNQ0096 | His-tag affinity SPA beads |
Citalopram, [N-Methyl-3H] | PerkinElmer | NET1039250UC | |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | heating block for thermostability assay |
ThermoTop | Eppendorf | 5308000003 | |
SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates | Eppendorf | 5306000006 | |
0.2 µm syringe filter | Olympus Plastics | 25-243 | |
1 L filter system | Corning | 430517 | |
2 L flat bottom tissue culture flask | Genemate | F-5909-2000 | |
2 L baffled tissue culture flask | Genemate | F-5909-2000B | |
CO2 incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
Forma Orbital Shaker | Thermo Scientific | 416 | |
Strep-Tactin resin | Iba Life Sciences | 2-1208-025 | Strep affinity resin |
Extruder | Northern Lipids | ||
Li-Cor imaging system | Odyssey | western blot imaging system | |
XK16 column | GE Healthcare | 28-9889-37 | column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton |
100 kDa MWCO protein concentrator | Millipore | UFC910096 | |
30 kDa MWCO protein concentrator | Millipore | UFC903024 | |
Äkta FPLC | GE Healthcare | UPC-900 | |
HPLC | Shimadzu | 51476 | |
Superose 6 (10/300) column | GE Healthcare | 17-5172-01 | Used for FSEC |
Tangential flow apparatus | Pall Filtron | ||
0.2 µm filter tangential flow cell | Pall Filtron | PSM20C11 | |
30 kDa MWCO tangential flow concentrator | Pall Filtron | OS030T12 | |
Talon resin | Clonetech | 635504 | His-tag affinity resin used for Fab purification |
1 ml HiTrap SP column | GE Healthcare | 17115101 | Cation exchanger used for Fab purification |
Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | Used for SEC separation of SERT-8B6 |
24-well VDXm plate | Hampton Research | HR3-306 | |
18 mm coverslips | Hampton Research | HR3-239 | |
Virocyt virus counter | Virocyt | 2100 | |
MicroBeta Trilux | PerkinElmer | 1450 | 96-well scintillation counter |
HiTrap SP column | GE Healthcare | 17115101 | |
Sertraline | Sigma | S6319 |