वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी ऊतक से प्राथमिक मिश्रित glial संस्कृति की तैयारी
Summary
न्यूरोपैथिक दर्द के विकास के रीढ़ की हड्डी glial कोशिकाओं की रोग परिवर्तन शामिल है। एक विश्वसनीय glial संस्कृति प्रणाली वयस्क रीढ़ की हड्डी के ऊतकों से ली गई है और इन विट्रो में इन कोशिकाओं के अध्ययन के लिए डिज़ाइन किया गया कमी है। इसलिए, हम यहाँ वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी के ऊतकों से प्राथमिक मिश्रित glial संस्कृतियों स्थापित करने के लिए कैसे दिखा।
Abstract
यह अच्छी तरह से स्वीकार किया गया है कि रीढ़ की हड्डी glial प्रतिक्रियाओं न्यूरोपैथिक दर्द के विकास में महत्वपूर्ण योगदान करते हैं। सेलुलर और आणविक स्तर पर glial गतिविधियों के बारे में जानकारी जबरदस्त इन विट्रो सेल संस्कृति प्रणालियों के माध्यम से प्राप्त किया गया है। इन विट्रो प्रणालियों में उपयोग किया, मुख्य रूप से प्राथमिक glia नवजात मस्तिष्क cortical ऊतकों से निकाली गई शामिल हैं और सेल लाइनों अमर। हालांकि, इन प्रणालियों विवो में रीढ़ की हड्डी glial कोशिकाओं की विशेषताओं को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता। आदेश में आगे एक संस्कृति प्रणाली है कि बेहतर विवो हालत को दर्शाता है का उपयोग कर परिधीय तंत्रिका चोट प्रेरित न्यूरोपैथिक दर्द के विकास में रीढ़ की हड्डी glial कोशिकाओं की भूमिका की जांच करने के लिए, हमारी प्रयोगशाला से प्राथमिक रीढ़ की हड्डी मिश्रित glial संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक विधि विकसित की है वयस्क चूहों। संक्षेप में, रीढ़ की हड्डी डोरियों वयस्क चूहों से एकत्र की है और एक भट के साथ माइलिन हटाने के बाद PAPAIN पाचन के माध्यम से कार्रवाई कर रहे हैंअल्पसंख्यक-ढाल माध्यम। एकल कक्ष निलंबन 35.9 ओ सी पर पूरा Dulbecco संशोधित ईगल मीडिया (cDMEM) 2-मर्केप्टोइथेनाल (2-ME) के साथ पूरक में सुसंस्कृत हैं ये संस्कृति की स्थिति मिश्रित glial कोशिकाओं के विकास के लिए विशेष रूप से अनुकूलित कर रहे थे। इन शर्तों के तहत, कोशिकाओं के बीच 12 प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं – 14 डी संस्कृति की स्थापना (डी 0) के बाद (कोशिकाओं इस समय के दौरान लॉग चरण में आम तौर पर कर रहे हैं) और डी 21 अप करने के लिए संस्कृति की स्थिति में रखा जा सकता है। इस संस्कृति प्रणाली विभिन्न पदार्थों और एजेंटों के साथ उत्तेजना पर रीढ़ की हड्डी glial कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। न्यूरोपैथिक दर्द के अलावा, इस प्रणाली अन्य बीमारियों कि रीढ़ की हड्डी glial कोशिकाओं की रोग परिवर्तन को शामिल में glial प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
पुराने दर्द एक गंभीर स्वास्थ्य समस्या को 635 $ 1 अरब की अनुमानित वार्षिक लागत के साथ, संयुक्त राज्य अमेरिका में लगभग 100 मिलियन वयस्कों को प्रभावित करता है। बढ़ते सबूत न्यूरोपैथिक दर्द, पुराने दर्द 2 के सबसे अधिक विनाशकारी प्रकार से एक के विकास में रीढ़ की हड्डी glial कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण योगदान संकेत दिया है। एक उचित इन विट्रो संस्कृति प्रणाली आगे सेलुलर और आणविक स्तर पर glial कोशिकाओं की भूमिका की जांच में काफी मदद मिलेगी।
वर्तमान में, इन विट्रो glial संस्कृति प्रणालियों शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग नवजात माउस या चूहे के दिमाग के cortical ऊतकों से निकाली मुख्य रूप से glial कोशिकाओं glial सेल लाइनों नवजात माउस से निकाली गई शामिल हैं और अमर या प्राथमिक glial कोशिकाओं चूहा। नवजात कोशिकाओं, undifferentiated कोशिकाओं की बड़ी संख्या है कि आगे glial कोशिकाओं में भेदभाव किया जा सकता (मुख्य रूप से astrocytes और microglia) होते हैं, इस प्रकार एक प्रदानप्रयोगात्मक उपयोग के लिए 3 bundant कोशिकाओं। हालांकि, हमारे पिछले एक अध्ययन से पता चला है कि नवजात मस्तिष्क glial कोशिकाओं पर lipopolysaccharide (LPS) उत्तेजना वयस्क रीढ़ की हड्डी glial कोशिकाओं से काफी अलग तरह से प्रतिक्रिया व्यक्त की। उदाहरण के लिए, इंटरल्यूकिन (IL) -4 LPS प्रेरित नाइट्रिक ऑक्साइड पर निरोधात्मक प्रभाव बढ़ाया प्रदर्शित (सं) वयस्क चूहे रीढ़ की हड्डी glia में उत्पादन नवजात मस्तिष्क glia 4 की तुलना में। इसके अलावा, एक neuropeptide द्वारा उत्तेजना पर केमोकाइन उत्पादन की प्रोफाइल, कैल्सीटोनिन जीन संबंधी पेप्टाइड (CGRP), नवजात माउस मस्तिष्क glia के बीच unarguably अलग हैं (रेफरी में वर्णित विधि। 5) और वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी glia (चित्रा 1)। स्थापित सेल लाइनों का उपयोग करने और बनाए रखने के लिए आसान कर रहे हैं और एक कम समय अवधि में कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या प्रदान कर सकते हैं। सामान्य तौर पर, अमर सेल लाइनों उत्पन्न या तो 6, 7 या निम्न वें (जैसे व्यापक रूप से इस्तेमाल microglial सेल लाइन BV2 के रूप में) एक वायरस की मध्यस्थता अमरता प्रणाली का उपयोग कर रहे हैंसहज परिवर्तन के ई पहचान 8, 9 सेल लाइनों astrocytes और microglia व्यक्तिगत रूप से की आणविक विशेषताओं का अध्ययन करने में बहुत ही अच्छे हैं (astrocyte सेल लाइन C8-D1A और microglial सेल लाइन सी 8-बी 4 के रूप में इस तरह के)। हालांकि, सेल लाइनों से प्राप्त परिणामों हमेशा प्राथमिक कोशिकाओं में या विवो परिस्थितियों में आगे सत्यापन की आवश्यकता है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि वहाँ एक glial सेल लाइन एक कृंतक रीढ़ की हड्डी glia से प्राप्त होता है की एक रिपोर्ट नहीं किया गया है।
न्यूरोपैथिक दर्द, एक संस्कृति प्रणाली वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी से ली गई है कि वयस्क चूहे मिश्रित glial संस्कृतियों 4 उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल एक पूर्व-सूचना विधि आदत डाल द्वारा विकसित किया गया है, 5 के विकास में रीढ़ की हड्डी glial कोशिकाओं की भूमिका की जांच में मदद करने के लिए । माउस रीढ़ की हड्डी glial संस्कृति आगे हाल ही में 10 परिष्कृत किया गया था और इस लेख में और अधिक विस्तार से वर्णन किया गया है। एडल्ट रीढ़ की हड्डी मिश्रित glial संस्कृतियों गएक का चयन किया उपभेदों कि विशेष रूप से अध्ययन की जरूरत है फिट से एक माउस के साथ स्थापित किया जा सकता है, और कोशिकाओं घ पोस्ट संस्कृति की दीक्षा अप करने के लिए 21 के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है। इस विधि के साथ ही विभिन्न मस्तिष्क संबंधी बीमारियों कि इस तरह के Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस (ए एल एस), मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) -associated संवेदी न्यूरोपैथी, और कई के रूप में रीढ़ की हड्डी के भीतर रोग परिवर्तन, शामिल की जांच में, न्यूरोपैथिक दर्द के अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है काठिन्य (एमएस)।
Protocol
Representative Results
Discussion
ये सभी कदम-सहित मीडिया आदेश प्रयोगों के बीच प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए तय समय में बदलने के लिए एक सुसंगत तरीके से प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है। निम्नलिखित कदम विशे…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.
Materials
| Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5g/L glucose | Lonza | 12-709F | The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media. |
| L-Glutamine (100x) | Lonza | 17-605E | The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine. |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Corning-Mediatech | 30-004-CI | This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 µg/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component. |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | Sigma-Aldrich | M3148 | A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis. |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | Individual components of this kit can be purchased separately. |
| Percoll | GE Health Care | 17-0891-01 | Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed. |
| Lab-line incubator/shaker | Barstead/Lab-line | MaxQ4000 | This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead. |
| Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 | Sigma-Aldrich | L-9764 | Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary. |
| Mouse IL-6 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY406 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA | R&D Systems | DY410 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA | R&D Systems | DY466 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set | BD Biosciences | 555260 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse chemokine Q-Plex | Quansys Biosciences | 120251MS | This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis. |
| APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) | eBioscience | 17-0451 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
| FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 11-0112 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
| Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | BD Accuri C6 | Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers. |
| FlowJo software | Tree Star, Inc. | FlowJo7.6.5 | Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers. |
References
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