Introduction
중추 신경계의 생체 내 모델 (CNS) 질환은 뇌에 이러한 약물, 병원균 또는 엑소 좀과 같은 외래 물질의 효과적인 전달을 필요로한다. 따라서, 이상적인 전달 방법은 동물에게 최소의 외상을 유발하는 신경 네트워크의 무결성을 유지하고, 뇌 한 높은 약물 농도를 달성한다.
지방 물질 전달의 여러 가지 수술 방법은 인트라 - 시스, 뇌내, 뇌 실내 주사 나 주입, 2, 3, 4, 5를 포함하여 기술되었다. 이러한 방법은 그러나, CNS 외상으로 간주하고, 관심 물질의 낮은 양의 관리를 허용한다. 또한, 외인성 물질이 빠르게 뇌척수액 (6)에 의해 제거 할 수 있다고 제안되어왔다 7 관찰되었다. 그들은 CNS에 물질 전달이 낮은 효과를 발휘하지만 경구, 폐, 피하, 정맥 내 경로 등의 전신 전달 방법은 흔히 다른 기관 (8), (9)의 흡수로 인해, 동물 모델에서 이용된다. 따라서, 전달 노선들은 부작용 및 독성이 10, 11의 위험을 증가 투여 물질의 높은 투여 량을 필요로한다.
여기서는 효과적으로 직접 내부 경동맥을 통해 뇌로 물질을 제공하는 마우스 미세 주입 기술을 설명한다. 중추 신경계에 대한 전달을 대상으로하는 것 외에도,이 기술은 정상적인 생리 장벽을 우회하므로 biologica에 매우 관련이없는뇌 내로 치료제 또는 병원체 통로 (L)에 관여 프로세스.
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Protocol
다음 프로토콜에 관련된 절차는 마이애미 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 또한, 모든 절차는 실험 동물 관리 국제 평가 및 인증 협회 (AAALAC)의 승인을 시설에서 진행되고있다.
외과 마우스 1. 준비
- 실험실 마취 시스템을 이용하여, 산소와 혼합하여 이소 플루 란 마취 마우스. 2 L에 %와 산소 흐름 4-5 사이에 설정에서 이소 플루 란을 사용하여 / 상업 시스템에 분 (재료 표 참조). 실체 현미경 하에서 수술면에 동물을 전송하고, 노즈콘을 사용하여 마취를 유지 (- 2 L / 분으로 2.5 1.5 산소 유량 설정 이소 플루 란을 사용한다).
- 허걱없이 2 호흡 / 초 - 마우스 호흡 속도가 1 주위에 있는지 확인하십시오. 또한, 동물의 수염 자극 반응 페달 (R)가 발생하지 않도록eflex (발가락 핀치). , 수술 동안 적어도 매 5 분 호흡 속도와 노력을 모니터링합니다. 설치류 마취 모니터링을 위해 특정 기관 동물 관리 및 사용위원회 및 수의학 지침을 따르십시오.
- 건조 함을 예방하기 위해 멸균 면봉을 사용하여 각각의 눈에 대한 안과 용 윤활제 방울을 적용한다. 항 염증 및 통증을 완화하는 진통제의 투여는 권장합니다.
- 동물의 뒷면에 누워, 코 콘을 사용하여 마취를 유지한다.
- 지역을 에탄올 70 %와 클로르헥시딘로 3 회 닦아 동물의 목 영역을 청소합니다. (아래에 설명)을 면도칼을 사용하여 동물의 수술 영역을 면도.
경동맥 2. 해부 (CCA)
- 실체 현미경 하에서 전체 미세 절차를 수행합니다. 수술 가위를 사용하고 집게은 가슴 위에서 t 이하로, 목에 얕은 중간 선 절개를 수행그는 (약 3 ~ 4 cm)를 턱.
- 집게를 조심스럽게 분리 지방 및 결합 조직을 사용하여 기관을 노출시킨다.
- 더 영역을 노출, 목을 연장 마우스의 목에의 뒷면에 베개 (라운드 개체, 직경 약 0.5 cm)를 놓습니다.
- 조직 권취 또는 후크를 사용하여 조직을 분리한다.
- 기관의 동물의 왼쪽에서 조심스럽게 왼쪽 CCA를 노출 할 수있는 결합 조직을 분리 tweeze.
- 사용 포셉 신중하게 CCA의 분기점을 노출하는 모든 결합 조직, 모두 외부 및 내부 경동맥의 시작을 제거합니다.
약물 주입을위한 CCA 3. 준비
- 집게를 사용하여, 외부 경동맥에서 나일론 봉합사 (약 1cm 각)의 두 개의 세그먼트 (ECA)를 삽입합니다.
- ECA의 가능한 가장 높은 지점에서 영구 매듭을 놓습니다.
- ECA의 가능한 가장 낮은 지점, 바로 CCA의 분기점 위의 장소에서이동식 매듭. 이 매듭은 상부 매듭에 비해 느슨합니다.
- 가장 낮은 지점에서, 용기 클립을 사용하여 CCA를 닫습니다.
- 용기 클립을 사용하여 내 경동맥 (ICA)를 닫는다.
- 사용하여 미세 절제 스프링 가위는 두 매듭 사이 ECA (약 2mm)에 작은 상처를 수행합니다.
ICA를 통해 4. 약물 주입
- 주입 시스템을 조립합니다. 모세관 튜브 6 인치 (이상적인 크기 : 2.5 mm X 1.2 mm)를 부착 물질의 250 μl를 포함하는 투베르쿨린 주사기는 (마약, 병원균, 다른 사람의 사이에서 세포 외 소포를) 주입 및 수행 절개로 부드럽게 모세관 팁을 삽입한다 단계 3.6 인치
- 가 분기와 CCA를 폐쇄 클립 사이의 중간 점에 도달 할 때까지 모세관을 아래로 슬라이드를 계속합니다.
- 낮은 ECA 매듭을 묶어. 매듭은 모세관 유동을 허용 할 정도로 느슨하고 leakin을 방지하기에 충분히 단단한 지 확인지.
- ICA에에서 클립을 제거합니다.
- 조심스럽게 주사기 피스톤 허용 물질 주입 초당 약 10 μL에 압력을 적용합니다.
5. 사후 주입 절차
- 장소는 ICA에 다시 클립.
- 조심스럽게 모세관 튜브를 제거합니다.
- 완전히 낮은 ECA 매듭을 묶어.
- ICA에와 CCA에서 클립을 제거합니다.
6. 절개 결산 및 수술 후 케어
- 트랙터 또는 조직 후크와 베개를 제거합니다.
- 멸균 생리 식염수를 사용하여 청소 봉합 영역입니다.
- 나일론 봉합사 / 바늘과 집게를 사용하여 절개를 닫습니다.
- 항 염증 및 진통이 수술 후 불편 함을 완화하기 위해 관리 할 수 있습니다.
- 적어도 1 시간 모니터 복구를 위해 가열 패드에 배치 새장에 동물을 배치합니다.
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Representative Results
여기에 설명 된 마우스 미세 주입 기술은 매우 다목적 뇌 전이의 형성 (1) (12)의 대표 모델에서 종양 세포의 전달을 포함하여 직접 뇌에 다른 물질을 전달하기 위해 사용되어왔다.
이 기술은 또한 CNS 다른 병원균의 병리학 적 양상을 평가하기에 적합하다. HIV 감염의 마우스 모델에서, 주입은 수술 CCA 직접 바이러스 입자를 주입 하였다. 우리는 7 일 수술 후 CNS 실시간 PCR에 의해 HIV 양성 것으로 나타났습니다. 또한, 동측 반구 감염은 6-10 반대편 반구 (그림 2)보다 높은 주름이었다.
여기에 설명 된 주입 수술의 또 다른 적절한 방법은 제공하는 것입니다 중추 신경계에 세포 외 소포 (ECVs), 주로 엑소 좀. 그림 3은 주입 후 마우스 24 시간의 동측 뇌의 녹색 형광 단백질 (GFP)으로 표시 CD63, 엑소 좀 마커의 존재를 보여줍니다.
그림 1 : 내부 경동맥의 동맥을 통해 주입의 도식 표현. 삽입 위치 (a) 및 (b)는 각각 상부 및 하부 노트의 위치 파악을 도시한다; (c)는 모세관 튜브가 삽입 통과하는 ECA의 작은 컷 (회색 선)을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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내부 경동맥을 통해 바이러스 주입 후 실시간 PCR에 의해 HIV 검출 : 그림 2. 바 7 일 왼쪽 경동맥을 통해 주입을 게시 생쥐에서 수확 평균 HIV DNA 수준을 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 내부 경동맥을 통해 ECVs 주입 후 마우스 뇌 섹션 묘사 GFP - 태그 CD63, 엑소 좀 마커의 면역 형광. 대표적인 이미지는 CD63 발현 ECVs (녹색)에 연결된 마우스 뇌 미세 혈관을 나타낸다. 스케일 바 : 50 μm의.= "_ 빈"을 얻을>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 주입 미세는 본체 (1), (12)을 통해 원치 않는 확산을 방지 CNS에 다양한 생물학적 기능 외인성 물질을 전달하는 매우 성공적인 것으로 판명되었습니다. 혈액 - 뇌 장벽을 중단 여러 CNS 관련 질환의 병리학 적 특징이다; 따라서 혈뇌 장벽 외인성 물질의 관계를 평가하는 것은 매우 중요하고 흥미 롭다.
선물이 수술 모델 동물에 제한 외상의 원인과 매우 낮은 사망률 (1), (12)와 연결되어 있습니다. 또한, 상기 절차는 CNS 기능 또는 뇌 혈류 1 (12)과 간섭하지 않는다. 이 방법의 가장 중요한 측면만을 허용해야하는 상기 ECA 올바른 절단을 수행 할 수있다모세관 튜브의 삽입. 더 넓은 컷 반대 사이트의 다른 ECA 수술을 필요로하는, 물질의 누출이 주입되는 원인이됩니다. 이러한 상황을 방지하기 위해, 모세관 튜브는 상처보다 더 큰 직경을 가져야하며 또한 혈관을 통해 입구를 용이하게하기 위하여 날카로운 에지를 가져야한다. 기술적 특징에 대해 완전히 숙련 된 기술자는 20 분 내에이 수술을 수행 할 수있다.
이 기술의 주요 제한은 동일한 ICA 통해 한 번만 주입의 가능성이다. CNS에 사용되어야하며 전술 한 여기에 설명 된 하나 국지적 기술이 BBB 내의 새로운 양 및 음의 상호 작용에 대한 연구를 지원하기 위해,뿐만 아니라 병원균을 제공하는 잠재력을 가지고있다 microport 용기 내로 반복 물질 배달 약물 및 뇌에 생리 에이전트.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia instrument | Vetequip | 901806 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tool | 14558-09 | |
| Surgical forceps straight tip | Fine Science Tool | 00108-11 | |
| Surgical forceps angled tip | Fine Science Tool | 00109-11 | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-08 | |
| Nylon suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | |
| Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.) | Braintree Scientific | MRE01050 | |
| Closing suture | VWR | 95057-036 | |
| Isoflurane | Piramal | ||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | FisherScientific | 50-121-8005 |
References
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