Induktion af iskæmisk slagtilfælde og iskæmi-reperfusion i mus Brug Mellemøsten arterieokklusion Teknik og Visualisering af infarkt-området

Summary

We describe a mouse model of stroke induced by the occlusion of the middle cerebral artery using a silicone coated suture. The protocol can be applied to induce permanent occlusion or a temporary ischemia, followed by reperfusion.

Abstract

Cerebrovascular disease is highly prevalent in the global population and encompasses several types of conditions, including stroke. To study the impact of stroke on tissue injury and to evaluate the effectiveness of therapeutic interventions, several experimental models in a variety of species were developed. They include complete global cerebral ischemia, incomplete global ischemia, focal cerebral ischemia, and multifocal cerebral ischemia. The model described in this protocol is based on the middle cerebral artery occlusion (MCAO) and is related to the focal ischemia category. This technique produces consistent focal ischemia in a strictly defined region of the hemisphere and is less invasive than other methods. The procedure described is performed on mice, given the availability of several genetic variants and the high number of tests standardized for mice to aid in the behavioral and neurodeficit evaluation.

Introduction

Studiet af cardiovaskulær sygdom, såsom slagtilfælde, bygger på anvendelsen af in vivo-modeller. For at forstå det afsløres, iskæmi, lægemiddeltoksicitet og / eller behandling, er der et behov for at anvende en egnet, standardiseret, pålidelig og reproducerbar model af sygdommen, som muliggør sammenlignende undersøgelser mellem behandlingsgrupperne. I dette manuskript, bruger vi mus Som følge af tilgængeligheden af ​​et stort antal af transgene mus og standardiserede vurderingsmodeller. Raking scores til vurdering motoriske og adfærdsmæssige underskud efter eksperimentel iskæmisk slagtilfælde og følgende opsving er blevet udviklet ^{en, to.}

Flere iskæmiske slagtilfælde modeller er til rådighed, såsom fuldstændig global cerebral iskæmi, ufuldstændig global iskæmi, multifokal cerebral iskæmi og fokal cerebral iskæmi. Sidstnævnte gruppe er også den kategori af slagtilfælde mest udbredt hos patienter. De fleste af EvaNTS initieres ved dannelsen af ​​en embolisk eller thrombotisk okklusion ved eller nær midten cerebrale arterie (MCA). Givet disse parametre, den præsenterede model nøje efterligner sygdommen ætiologien af humant slagtilfælde og gør opnåede resultater yderst relevant ^3. Ikke desto mindre har oversættelsen af ​​opdagelser fra dyremodeller til sygdomsbehandling hos mennesker vist sig at være en udfordring. Hidtil har kun anvendelsen af trombolytisk vævsplasminogenaktivator blevet godkendt til behandling af akut iskæmisk slagtilfælde ^4.

Blandt modeller af fokal cerebral iskæmi i mus, posterior cerebral cirkulation slagtilfælde model og cerebral venøs trombose model er meget invasive, faldende deres anvendelighed og begrænse række analyser, der kan udføres. Imidlertid kan andre teknikker, såsom den emboliske model, photothrombosis model, endothelin-1-induceret slagtilfælde model, og intraluminale sutur mellem-cerebral arterieokklusion (MCAO) model, er tilgængelige til brug uden sådanne begrænsninger. Den MCAO modellen er en teknik, der er beskrevet i denne protokol. Det giver en pålidelig metode til at inducere fokal cerebral iskæmi, der let kan reperfunderet og udført i et high-throughput måde. Der er to tilgange til denne model, nemlig Zea-Longa og Koizumi metoder. De afvige lidt i vejen indsættes okklusion sutur i vaskulaturen. I Zea-Longa teknik, er suturen indsat via den eksterne carotidarterie ^5. Teknikken præsenteres her er modificeret fra Koizumi fremgangsmåde hvor okkluderende sutur er indsat via den fælles carotidarterie ^6.

Den MCAO model er blevet anvendt til at vurdere forskellige begivenheder, der opstår under iskæmisk slagtilfælde. Efter reperfusion, kan hjerneødem observeres sammen med nedbrydning af blod-hjerne-barrieren. Peak neuronal død er normalt observeret ved 24 timer; men det revender sig til baseline niveau efter 7 dage ^7. Hos mennesker, køn og alder er vigtige variabler ved bestemmelse udfald af slagtilfælde, er dette også iagttaget hos mus og rotter ^{8, 9, 10.} Adskillige publikationer har brugt MCAO model til at påvise behandlingseffektiviteten ^{11, 12, 13, 14.}

Protocol

Alle procedurer blev godkendt af University of Miami Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) i overensstemmelse med National Institutes of Health (NIH) retningslinjer. kræves til anvendelsen sterilt udstyr og aseptisk teknik. 1. Forberedelse af okklusion Sutur Brug en sutur mm i diameter 0,21 for mus på 20 – 25 g og 0,23 mm for mus på mellem 25 – 35 g legemsvægt. Valget af den type suturer for MCAO procedure er baseret på dyrs vægt. Ved hjælp af en sølv …

Representative Results

Indsættelsen rute for okklusionen sutur demonstreres i figur 1. Den MCAO sutur skal dirigeres til den okklusion område, bifurcating i ICA. Vellykket okklusion af MCA vil føre til vævsbeskadigelse, synligt ved TTC-farvning. Figur 2 viser billeder af pletter fra sham behandlede dyr (figur 2A) og fra en 60 min MCAO iskæmisk reperfusion dyr (farvning ved 90 min eller 24 timer efter okklusion, figur 2B). For at bestemme …

Discussion

Den vellykkede anvendelse af den beskrevne MCAO metoden er meget afhængig af en forståelse af cerebral blodstrøm anatomi. Da den korrekte placering af sutur er svært at skelne på grund af manglen af ​​direkte visuelle spor, gentagne praksis er vigtigt at mestre proceduren, før du bruger den til efterforskningsmæssige studier. Stroke volumen bør analyseres for at sikre ensartede resultater. Tilsætningen af ​​en laser Doppler system kan hjælpe til at bestemme den vellykkede okklusion af blodgennemstrømn…

Materials

MCAO suture 0.23mm	Doccol	702345PK5Re
MCAO suture 0.21mm	Doccol	702145PK5Re
Silver pen	staples	503205
Anesthesia machine	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine science tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine science tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine science tool	00109-11
Spring scissors	Fine science tool	15000-08
Nylon suture	Braintree scintific	SUT-S 104
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherSci	50-121-8005
Brain block	Braintree scintific	BS-A 5000C
Cryostat blade	VWR	89202-606
Optional:
Periflux Laser doppler system	Perimed	Periflux 5000
Monitoring unit	Perimed	PF 5010 – LDPM