Induksjon av hjerneinfarkt og iskemi-reperfusjon i Mus Bruke Midt arterieokklusjon Teknikk og visualisering av Infarkt området

Summary

We describe a mouse model of stroke induced by the occlusion of the middle cerebral artery using a silicone coated suture. The protocol can be applied to induce permanent occlusion or a temporary ischemia, followed by reperfusion.

Abstract

Cerebrovascular disease is highly prevalent in the global population and encompasses several types of conditions, including stroke. To study the impact of stroke on tissue injury and to evaluate the effectiveness of therapeutic interventions, several experimental models in a variety of species were developed. They include complete global cerebral ischemia, incomplete global ischemia, focal cerebral ischemia, and multifocal cerebral ischemia. The model described in this protocol is based on the middle cerebral artery occlusion (MCAO) and is related to the focal ischemia category. This technique produces consistent focal ischemia in a strictly defined region of the hemisphere and is less invasive than other methods. The procedure described is performed on mice, given the availability of several genetic variants and the high number of tests standardized for mice to aid in the behavioral and neurodeficit evaluation.

Introduction

Studiet av kardiovaskulær sykdom, slik som slag, er avhengig av bruk av in vivo-modeller. For å forstå den mulige innblanding av ischemi, legemiddeltoksisitet, og / eller behandling, er det et behov for å benytte en passende, standardisert, pålitelig og reproduserbar modell av sykdommen, noe som gjør det mulig for sammenlignende undersøkelser mellom behandlingsgruppene. I dette manuskriptet, har vi ved hjelp av mus, gitt tilgjengelighet av et stort antall transgene mus og standardiserte vurderingsmodeller. Raking score for å vurdere motoriske og atferds underskudd følgende eksperimentelle iskemisk hjerneslag og følgende bedring er blitt utviklet ^{en, to.}

Flere hjerneinfarkt modeller er tilgjengelige, for eksempel komplett global cerebral iskemi, ufullstendig global ischemi, multifokal cerebral iskemi og fokal cerebral iskemi. Den sistnevnte gruppen er også den kategori av slag mest utbredt i pasienter. Flertallet av events igangsettes ved at det dannes en embolic eller trombotisk okklusjon ved eller i nærheten av den midtre cerebrale arterie (MCA). Gitt disse parametrene, modellen presenteres etterligner nøye sykdom etiologi av menneskelig slag og gjør resultatene oppnådd svært relevant ^3. Likevel har oversettelse av funn fra dyremodeller til sykdomsbehandling hos mennesker vist seg å være utfordrende. Opp til nå har bare anvendelse av trombolytiske vevsplasminogenaktivator blitt godkjent for behandling av akutt iskemisk hjerneslag ^4.

Blant modeller av fokal cerebral ischemi i mus, bakre cerebral sirkulasjon slagmodell og cerebral venøs trombose modell er meget invasiv, avtagende deres anvendbarhet og begrense omfanget av analyser som kan utføres. Imidlertid kan andre teknikker, slik som embolisk modell, photothrombosis modell, endotelin-1 indusert slagmodell, og intraluminal sutur tilstopping av midtre cerebralarterie (MCAO) modell, er tilgjengelig for bruk uten slike begrensninger. Den MCAO-modellen er en teknikk som er beskrevet i denne protokollen. Det gir en pålitelig metode til å indusere fokal cerebral ischemi som lett kan reperfusert og utført i en high-throughput måte. Det er to tilnærminger til denne modellen, nemlig Zea-Longa og Koizumi metoder. De skiller seg noe i veien okklusjonen suturen er satt inn i vaskulaturen. I Zea Longa-teknikk, er suturen inn via den ytre halsarterie ^5. Teknikken som presenteres her er modifisert fra den Koizumi fremgangsmåte hvor det okkluderende suturen er innført via arteria carotis communis ^6.

Den MCAO modellen har blitt brukt til å evaluere ulike hendelser som skjer mens hjerneinfarkt. Etter reperfusjon kan hjerneødem observeres sammen med nedbrytning av blod-hjerne-barrieren. Peak neuronal død er vanligvis observert på 24 timer; men det kan dessslår til utgangsnivået etter 7 dager ^7. Hos mennesker, kjønn og alder er viktige variable ved bestemmelse av slag resultat, er dette også observert i mus og rotter ^{8, 9, 10.} Flere publikasjoner har brukt MCAO-modell for å demonstrere renseeffekt ^{11, 12, 13, 14.}

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av University of Miami Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) i samsvar med National Institutes of Health (NIH) retningslinjer. Bruken til sterilt utstyr og aseptiske teknikker er nødvendig. 1. Klar Okklusjon Sutur Bruke en sutur med en diameter på 0,21 mm for mus mellom 20 – 25 g og 0,23 mm for mus mellom 25 – 35 g kroppsvekt. Valget av type av suturer for MCAO fremgangsmåten er avhengig av dyrets vekt. Ved hjelp av en sølv …

Representative Results

Innførings rute for okklusjonen sutur er vist i figur 1. Den MCAO sutur skal rutes til okklusjonen området, bifurcating i ICA. Vellykket okklusjon av MCA vil føre til vevsskade, synlig ved TTC farging. Figur 2 viser bilder av flekker fra sham behandlede dyr (figur 2A) og fra en 60 min MCAO ischemi reperfusjon dyr (farging ved 90 minutter eller 24 timer etter okklusjon, figur 2B). For å bestemme slagvolum, først bere…

Discussion

Den vellykkede bruk av den beskrevne fremgangsmåten MCAO er sterkt avhengig av en forståelse av cerebral blodstrøm anatomi. Siden riktig plassering av sutur er vanskelig å skjelne på grunn av mangel på direkte visuelle ledetråder, er gjentatt praksis viktig å mestre prosedyren før du bruker den for undersøkende studier. Slagvolum bør analyseres for å sikre konsistente resultater. Tilsetningen av et laser-Doppler-system kan bidra til å bestemme vellykket okklusjon av blodstrøm og bør brukes periodisk for ?…

Materials

MCAO suture 0.23mm	Doccol	702345PK5Re
MCAO suture 0.21mm	Doccol	702145PK5Re
Silver pen	staples	503205
Anesthesia machine	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine science tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine science tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine science tool	00109-11
Spring scissors	Fine science tool	15000-08
Nylon suture	Braintree scintific	SUT-S 104
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherSci	50-121-8005
Brain block	Braintree scintific	BS-A 5000C
Cryostat blade	VWR	89202-606
Optional:
Periflux Laser doppler system	Perimed	Periflux 5000
Monitoring unit	Perimed	PF 5010 – LDPM