La inducción de ictus isquémico y la isquemia-reperfusión en ratones con la técnica de oclusión de la arteria Medio y Visualización de un infarto Área

Summary

We describe a mouse model of stroke induced by the occlusion of the middle cerebral artery using a silicone coated suture. The protocol can be applied to induce permanent occlusion or a temporary ischemia, followed by reperfusion.

Abstract

Cerebrovascular disease is highly prevalent in the global population and encompasses several types of conditions, including stroke. To study the impact of stroke on tissue injury and to evaluate the effectiveness of therapeutic interventions, several experimental models in a variety of species were developed. They include complete global cerebral ischemia, incomplete global ischemia, focal cerebral ischemia, and multifocal cerebral ischemia. The model described in this protocol is based on the middle cerebral artery occlusion (MCAO) and is related to the focal ischemia category. This technique produces consistent focal ischemia in a strictly defined region of the hemisphere and is less invasive than other methods. The procedure described is performed on mice, given the availability of several genetic variants and the high number of tests standardized for mice to aid in the behavioral and neurodeficit evaluation.

Introduction

El estudio de la enfermedad cardiovascular, tal como apoplejía, se basa en el uso de modelos in vivo. Para entender la posible implicación de la isquemia, la toxicidad del fármaco, y / o tratamiento, hay una necesidad de usar un modelo adecuado, estandarizado, fiable y reproducible de la enfermedad, lo que permite estudios comparativos entre los grupos de tratamiento. En este manuscrito, estamos utilizando ratones, dada la disponibilidad de un gran número de ratones transgénicos y los modelos de evaluación estandarizados. Rastrillar puntajes para evaluar los déficits motores y de comportamiento después del accidente cerebrovascular isquémico experimental y el después de la recuperación han sido desarrollados ^{1, 2.}

Varios modelos de accidente cerebrovascular isquémico están disponibles, tales como isquemia global completa cerebral, isquemia global incompleta, isquemia cerebral multifocal y la isquemia cerebral focal. El último grupo es también la categoría de derrame cerebral más frecuente en los pacientes. La mayoría de las vísperasnts se inician por la formación de una oclusión embólica o trombótica en o cerca de la arteria cerebral media (MCA). Teniendo en cuenta estos parámetros, el modelo presentado estrechamente imita etiología de la enfermedad de apoplejía humana y hace que los resultados obtenidos altamente relevante ^3. Sin embargo, la traducción de los descubrimientos de modelos animales para el tratamiento de enfermedades en los seres humanos ha demostrado ser un reto. Hasta ahora, sólo el uso de activador de plasminógeno tisular trombolítico se ha aprobado para el tratamiento del ictus isquémico agudo ^4.

Entre los modelos de isquemia cerebral focal en ratón, modelo accidente cerebrovascular circulación cerebral posterior y modelo de trombosis venosa cerebral son altamente invasivos, disminuyendo su aplicabilidad y la restricción de la gama de análisis que se pueden realizar. Sin embargo, otras técnicas, tales como el modelo embólico, modelo photothrombosis, modelo de carrera de la endotelina-1 inducida, y oclusión de la arteria cerebral media de sutura intraluminal (MCAO modelo), están disponibles para su uso sin tales limitaciones. El modelo MCAO es una técnica descrita en este protocolo. Ofrece un método fiable de inducir isquemia cerebral focal que puede ser fácilmente reperfundido y realiza de una manera de alto rendimiento. Hay dos enfoques para este modelo, a saber, los métodos de Zea-Longa y Koizumi. Se diferencian ligeramente en la forma en que se inserta la sutura oclusión de la vasculatura. En la técnica de Zea-Longa, la sutura se inserta a través de la arteria carótida externa ^5. La técnica que aquí se presenta es una modificación del método de Koizumi en el que la sutura oclusiva se inserta a través de la arteria carótida común ^6.

El modelo MCAO se ha aplicado con éxito para evaluar los diferentes eventos que se producen durante el accidente cerebrovascular isquémico. Después de la reperfusión, edema cerebral puede ser observado junto con la ruptura de la barrera sangre-cerebro. la muerte neuronal pico se observa generalmente a las 24 horas; sin embargo, se reconvierte a los niveles basales después de 7 días ^7. En los seres humanos, el sexo y la edad son variables importantes en la determinación pronóstico del accidente cerebrovascular, esto también se observa en ratones y ratas ^{8, 9, 10.} Varias publicaciones han utilizado el modelo MCAO para demostrar la eficacia del tratamiento ^{11, 12, 13, 14.}

Protocol

Todos los procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Miami Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Se requiere el uso de equipo estéril y técnicas asépticas. 1. Preparación de la oclusión de la sutura Utilice una sutura de mm de diámetro 0,21 para los ratones entre 20 a 25 g y 0,23 mm para los ratones entre 25 – 35 g de peso corporal. La elección del tipo de suturas para el procedimi…

Representative Results

La ruta de inserción para la sutura oclusión se demuestra en la Figura 1. La sutura MCAO se va a encaminar a la zona de la oclusión, bifurcándose en el ICA. oclusión de la MCA éxito dará lugar a la lesión tisular, visible por tinción con TTC. La Figura 2 presenta imágenes de tinción de tratados sham animales (Figura 2A) y de un 60 min MCAO animales isquemia reperfusión (tinción en 90 min o 24 horas después de la oclusión, …

Discussion

La utilización con éxito de la MCAO método descrito depende de una comprensión de la anatomía del flujo sanguíneo cerebral altamente. Desde la correcta colocación de la sutura es difícil de discernir debido a la falta de pistas visuales directos, la práctica repetida es importante dominar el procedimiento antes de usarla para estudios de investigación. El volumen de eyección debe ser analizado para asegurar resultados consistentes. La adición de un sistema de láser Doppler puede ayudar a determinar el éxit…

Materials

MCAO suture 0.23mm	Doccol	702345PK5Re
MCAO suture 0.21mm	Doccol	702145PK5Re
Silver pen	staples	503205
Anesthesia machine	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine science tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine science tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine science tool	00109-11
Spring scissors	Fine science tool	15000-08
Nylon suture	Braintree scintific	SUT-S 104
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherSci	50-121-8005
Brain block	Braintree scintific	BS-A 5000C
Cryostat blade	VWR	89202-606
Optional:
Periflux Laser doppler system	Perimed	Periflux 5000
Monitoring unit	Perimed	PF 5010 – LDPM