可视化痰生物膜发展影响使用腔室盖玻片型号
Summary
This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.
Abstract
生物膜是由以自分泌的基质包裹细菌的群体。它们在工业污染，以及在许多健康相关性感染的发展和维持中发挥重要作用。一种在人类疾病中最充分描述并研究生物膜发生在囊性纤维化患者的慢性肺部感染。当在主机的情况下学习生物膜，许多因素会影响生物膜的形成和发展。为了鉴定宿主因素如何影响生物膜的形成和发展，我们使用一个静态腔室盖玻片方法中的宿主衍生的因子在痰上清液的形式存在下生长生物膜。细菌接种到商会和暴露于痰滤液。继增长48小时，生物膜沾满共聚焦显微镜和分析之前的商业可行性生物膜套件。以下图像采集，生物膜特性可以使用不同的软件平台来评估。这个方法允许我们想象中不同物质，包括抗生素的存在生物膜生长的关键性质。
Introduction
细菌生物膜是微生物组附加到彼此并以自分泌的基质包裹。 1,2-传统上，它们代表细菌物理连接到流量的条件下形成的非生物或生物的表面上。生物膜也已经显示在静态条件（无流动）和远离表面，如在形成于试管热水池或药膜的空气 – 液体界面生长。这些生物膜早已在环境中识别和是主要损害工业过程，因为它们可以在蓄水池或管道形成，导致生物结垢，腐蚀和堵塞。 3,4
生物膜也是在医疗设置关键的，因为它们已被证明参与导管相关感染，囊性纤维化患者的肺感染，以及在许多其他感染。 5,6-一个生物膜感染的标志是德折痕细菌对抗生素的敏感性，并通过先天免疫系统受损的间隙。 7-9最充分研究，涉及基于生物膜感染临床相关情形发生在患者的囊性纤维化（CF），谁是慢性感染绿脓杆菌生物膜。 铜绿假单胞菌能建立慢性感染，使得它很难治疗的过程中发生了一些变化。 10,11生物膜可以激活差异的先天免疫和炎症驱动。 12-14由于这些感染导致CF患者发病率和死亡率，它是要明白，在这方面可以影响生物膜发展的因素是至关重要的。
最近的一项研究表明，宿主因素是在铜绿假单胞菌生物膜聚集体的形成是至关重要的。 15这些生物膜有助于减少对抗生素的敏感性和宿主防御机制。该prese的宿主衍生的因素，如嗜中性粒细胞弹性蛋白酶，以及来自本在CF肺部的微生物分泌的产品NCE，必须大大调制生物膜形成和发展的潜力。 16此外，生物膜与宿主相互作用来调节多种途径表达并开始发炎。而高通量的方法，例如标准的结晶紫测定法中，可以为用户提供关于生物膜过程中的一些信息，响应于这些因素的生物膜的可视化提供更深入的信息。
在这个手稿我们描述了使用来自CF患者的痰因素来研究生物膜的体外发育的方法。此方法允许暴露于使用商业生物膜存活包含痰宿主因素生物膜的快速可视化。这种技术可以用于可视地识别在exogeno存在生物膜生长过程中发生的变化我们的产品，并表示改进的方法来分析各种条件下的生物膜发展的变化。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文描述的方法允许在外源产物的存在下生长的细菌生物膜的可视化。不令人惊讶地，使用这种类型的系统时生产exoproducts的是重要的。例如，二硫苏糖醇（DTT），经常被用来对人痰样品来帮助液化样本。然而，DTT的单独的效果可降低生物膜发展和活力（数据未显示）。因此，对于所有条件适当的控制是必要的。此外，加入的人类痰产品由于这一事实，即每个病人的痰中有一个独特的微生物产生?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TB承认囊性纤维化加拿大研究奖学金。
Materials
| Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well | Thermo Sicher Scientific | 155409 | |
| Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit | Thermo Fisher Scientific | L10316 | |
| Blood agar plates | Thermo Fisher Scientific | R10215 | Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation |
| COMSTAT | Availble software online | COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk | |
| Millers LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780-052 | Standard media for overnight gowth/biofilm growth |
| Millex-GV Syringe Filters | Millipore | SLGV013SL | Filtering of sputum supernants |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | Oxoid | BR0014G | Washing of biofilm chambers after media removal |
| Zeiss AxioVert 200M | Carl Zeiss | ||
| Hamamatsu C9100-13 EM-CCD | QS Technologies Inc. | ||
| Spectral Borealis | Qs Technologies Inc. | ||
| Perkin Elmer Volocity | QS Technologies Inc. | Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf |
References
- Beaudoin, T., Waters, V. Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy. Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
- Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes. FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).
- Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development. Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).
- Donlan, R. M. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O’Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada. Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).
- Vidya, P., et al. Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).
- Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).
- Beaudoin, T., et al. The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).
- LaFayette, S. L., et al. Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses. Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).
- Staudinger, B. J., et al. Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).
- Kennedy, S., et al. Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).
- Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Vorregaard, M. . Informatics and Mathematical Modelling. , (2008).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide. J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).
