JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Biologie

En In Vitro Model til at studere cellulær Transformation af Kaposis sarkom Herpesvirus

Published: August 25, 2017
doi:
10.3791/54828
, , , ,
1Division of Pediatric Infectious Diseases,University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute,Oregon Health and Science University

Summary

Kaposis sarkom (KS) er en tumor forårsaget af infektion med muterede virus humant herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). I endothelial celle kultur model beskrevet her er unikt tilpasset til at studere de mekanismer, hvorved KSHV forvandler værtsceller.

Abstract

Kaposis sarkom (KS) er en usædvanlig tumor bestående af spindel celler, der er initieret af infektion i endothelial celler (EF) med KSHV, og udvikler sig oftest i fastsættelsen af immunosuppression. Trods årtiers forskning, optimal behandling af KS forbliver dårligt defineret og kliniske resultater er især ugunstige i ressource-begrænset indstillinger. KS læsioner er drevet af patologiske angiogenese, kronisk inflammation og oncogenesis, og forskellige i vitro celle kultur modeller er blevet udviklet for at studere disse processer. KS udspringer af KSHV-inficerede celler i endothelial oprindelse, så EF-slægt celler giver de mest hensigtsmæssige i vitro surrogater af spindel celle forløber. Dog fordi EF har en begrænset in vitro- levetid, og som de muterede mekanismer, der er ansat af KSHV er mindre effektiv end andre tumorfremkaldende virus, har det været vanskeligt at vurdere processer af transformation i primære eller telomerase-udødeliggjort EC. Derfor, en roman EF-baserede kultur model blev udviklet som let understøtter transformation efter infektion med KSHV. Ektopisk udtryk for human papillomavirus type 16 E6 og E7 gener giver mulighed for udvidede kultur af alder – og passage-matchede mock – og KSHV-inficeret EF og støtter udviklingen af en virkelig omdannet (dvs., tumorfremkaldende) fænotype i inficerede cellekulturer . Denne tractable og stærkt reproducerbare model af KS har lettet opdagelsen af flere væsentlige signaling veje med stort potentiale for oversættelse i kliniske indstillinger.

Introduction

Kaposis sarkom (KS) er en multi focal angioproliferative tumor påvirker gennem huden, slimhinder og visceralt sites der udvikler sig oftest i fastsættelsen af avancerede immunsuppression1. Fire epidemiologiske former er blevet beskrevet: classic, en indolent form, der typisk rammer ældre mennesker i Middelhavsområdet og Mellemøsten arv; iatrogen, som følge af behandling med immunosuppressive lægemidler efter organtransplantation; epidemien, en AIDS-definerende kræft; og endemiske, en HIV-uafhængig form almindelige hos børn i endemiske områder i Afrika. Med fremkomsten af effektive kombination anti-retroviral medicin regimer til behandling af HIV er epidemi KS langt mindre almindeligt diagnosticeret i udviklingslande. Men de klinisk aggressive endemiske og epidemiske formularer stadig blandt de mest almindeligt diagnosticeret kræft i mange afrikanske lande2,3,4. Identifikation af effektive patogenese-målrettede lægemidler til behandling af KS er derfor prioriteres forskning.

Histologisk, er KS læsioner karakteriseret af omfattende, men unormal neovascularization hvorved spindel celler af EF-oprindelse danner diskontinuert vaskulære netværk5. Disse unormale fartøjer (“vaskulære slidser”) tillader ekstravasation af erytrocytter, som giver læsioner deres karakteristiske farve. Derudover indeholde læsioner talrige leukocytter, der karakteriserer kronisk betændelse (dvs., lymfocytter, makrofager og plasma celler). Regression af KS læsioner efter immun rekonstituering er blevet beskrevet, tyder på, at KS har funktioner i både et hyper-proliferativ læsion og en ægte tumor6,7,8,9.

KS herpesvirus (KSHV), det agens af KS, blev identificeret i 199410. Siden så mange in vitro- cellekultur modeller er blevet udviklet for at aktivere patogenese undersøgelser, herunder celler eksplanterede fra tumor biopsi materiale og primære eller at udtrykke telomerase EF inficeret med KSHV in vitro-11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. ingen af de aktuelt tilgængelige modeller fuldt sammenfatter KS tumor mikromiljø, men alle har bidraget med værdifuld viden til vores forståelse af pathobiology af KSHV infektion. I modsætning til de andre kendte tumorfremkaldende humant herpesvirus Epstein – Barr virus (EBV), KSHV ikke let transformere celler i kultur efter de novo infektion19,20,21, 22. imidlertid denne begrænsning har overvundet af transducing primære menneskelige EF af enten iblandet E6 mikrovaskulære eller lymfatisk oprindelse og E7 gener fra human papillomavirus type 16 forud for infektion med KSHV23,24 . Udtryk for disse eksogene onkogener øger dramatisk transformerende potentialet i KSHV in vitro- delvis ved at tilbyde yderligere hæmning af Retinoblastom-protein og p5323,–24. Denne EF transduktion metode har tilladt flere laboratorier til at identificere vigtige ændringer i vært celle genekspression der er fremkaldt af KSHV infektion og der synes at lette KS celle overlevelse og spredning25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. de protokoller er beskrevet heri er ligetil og meget reproducerbar, og vil resultere i generation af alder – og passage-matchede KSHV-inficerede EF og mock-inficerede objekter, der kan være kulturperler i langt længere tid end primærelementer og vil giver mulighed for undersøgelse af muterede mekanismer ansat af KSHV. Selv om protokollen inkluderer en metode til produktion af vildtype KSHV fra den primære effusion lymfom cellelinje BCBL-1, E6/E7-udødeliggjort EF er også meget modtagelige for stammer infektion med rekombinante BACmid KSHV-BAC1630. Protokoller for forberedelse af BAC16 er beskrevet andetsteds33,34.

Protocol

Bemærk: alle procedurerne i denne protokol bør udføres BSL-2 betingelser. 1. KSHV Stock forberedelse forberede TNE buffer: 292.24 mg EDTA i ddH 2 O opløses, bringe til 225 mL, og justeres til pH 8. 605.7 mg Tris i ddH 2 O opløses, bringe til 225 mL, og justeres til pH 8. Kombinere EDTA og Tris løsninger, tilføje 4,38 g NaCl, justere endelige mængden til 500 mL, filtrere steriliseres og opbevares ved 4 ° C . Kultur KSHV-positive, E…

Representative Results

Morfologi af primære EF er klassisk beskrevet som “cobble stone”, og denne morfologi ændres ikke af udtryk for papillomavirus E6, E7 gener (figur 1A). Udtryk af E6 og E7 gener alene fremkalde ikke en transformeret fænotype; således celler er modtagelige for kontakt hæmning og vil ophøre med at dividere ved ankomsten til sammenløbet i kultur. Cellerne vil dog formere og regrow til sammenløbet på trypsinization og replating på en lavere tæthedsgrad, giver mulighe…

Discussion

Oncogenesis er en omstændelig proces, der omgår vigtige sikkerhedsforanstaltninger inden for en organisme36. KS læsioner findes langs et spektrum af kronisk inflammation til sande sarkomer, kræver udredning af visse patofysiologiske processer, formidlet af KSHV at blive gennemført nogle undersøgelser i celle kultur modeller, der understøtter transformation9. Det skal bemærkes, at tab af kontakt hæmning og forankring-afhængige vækst, fænotyper vejledende for cell…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af K12 HD068322 (SCM); R01 CA179921 og P51 OD011092 (AVM); og tildele 14PRE20320014 fra Amerika Heart Association (SB).

Materials

BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi’s sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi’s sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi’s sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi’s sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma. Science. 266 (5192), 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi’s sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi’s sarcoma?. Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi’s sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi’s sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi’s Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi’s sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3′-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder, ., Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

Tags

Keywords: In Vitro ModelCellular TransformationKaposi Sarcoma HerpesvirusKSHVEndothelial CellsMalignant TransformationViral OncogenesisKaposi SarcomaPathological AngiogenesisBCBL-1 CellsPMAViral Particle IsolationUltracentrifugation
check_url/fr/54828?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image