Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.
A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.
Ictus durante il periodo neonatale è una causa importante di morte e disabilità, che si verificano in ben 1 a 2.300 nati vivi 1. Questo porta a sviluppo del sistema nervoso centrale alterata e aumentata morbilità a lungo termine, tra cui una maggiore incidenza di epilessia, paralisi cerebrale, ritardo mentale, e altri tipi di motore o disfunzione cognitiva. Gli effetti per tutta la vita di ictus precoce rendono modelli animali traslazionali essenziale per esaminare i meccanismi di danno e riparazione in questa popolazione, comprese le strategie per proteggere il cervello danneggiato o per migliorare la riparazione.
Diversi modelli di ischemia sono stati utilizzati per studiare le lesioni cerebrali in animali adulti, e mentre la Rice-Vannucci (Modificata Levine) 2 procedura viene comunemente utilizzato per studiare danno ipossico-ischemico nel cervello in via di sviluppo, focale ischemia-riperfusione è un meccanismo distinto di lesioni provocando lesioni focali, con un nucleo ferito e Penumbra e tessuti remoto indenne. I modelli Koizumi 3 e 4 Longa stati sviluppati in ratti adulti per raggiungere transitoria occlusione dell'arteria cerebrale media attraverso l'arteria carotide comune (CCA) e l'arteria carotide esterna (ECA), rispettivamente. In entrambi i modelli, la legatura permanente e cauterizzazione di rami dell'arteria sono importanti per ridurre al minimo il sanguinamento e di snellire la procedura chirurgica, che provoca anche effetti negativi sulla capacità dell'animale di alimentare e ad aumentare di peso dopo un trauma. Inoltre, ci sono distinti meccanismi di lesione nel cervello immaturo e modelli specifici di lesioni visti come risultato.
Più di recente, ictus photothrombotic (metodo Rose-Bengal) 5 e permanente legatura MCA 6 sono stati utilizzati per studiare ictus neonatale e adulti. Sia ictus photothrombotic e MCA legatura creano variazioni permanenti del flusso sanguigno cerebrale che si traducono in una mancanza di reperfusionico. Riperfusione è un componente critico di sviluppo e nella progressione di lesioni focali, con maggiore eccitotossicità, formazione di radicali liberi, e la produzione di ossido nitrico che porta alla morte cellulare ritardata che coinvolge cascate di segnalazione che sono distinti dalla fase ischemica 7. Ipossia-ischemia coinvolge permanente legatura unilaterale carotide seguita da ipossia globale, che varia da causa di danno ipossico-ischemico nell'uomo e non causa un pattern lesione focale costante, rendendo studio del nucleo danneggiato e penombra più impegnativo.
Abbiamo precedentemente descritto un modello ictus ischemia-riperfusione non emorragica nel ratto immaturo utilizzando transitoria cerebrale media occlusione dell'arteria (MCAO) 8, 9, 10. Questo è un metodo meno invasivo che accede e occlude il MCA attraverso l'arteria carotide interna senza ligati permanenteo cauterizzazione. Questo fornisce un modello di lesione simile alla causa più comune di ictus nel periodo perinatale 11, 12. Questo modello di ischemia-riperfusione dei risultati lesioni danni al corpo striato ipsilaterale e la corteccia parieto-temporale. Questo modello di tMCAO permette anche il controllo sulla gravità delle lesioni variando la durata di occlusione. L'esame delle vie di segnalazione e cambiamenti istologici nel nucleo ferito e penombra e nel tessuto ipsilaterale e controlaterale illeso possono ulteriormente chiarire i meccanismi di danno e riparazione del cervello immaturo. Questo studio dimostrerà questo importante modello di lesione per il cervello in via di sviluppo.
Passaggi critici all'interno del protocollo
In primo luogo, è importante mantenere normotermia decorrere dall'inizio di anestesia fino al completo recupero, in quanto non vi sono effetti di entrambi ipotermia 17 e 18 ipertermia sulla progressione del danno cerebrale sia in animali immaturi e maturi conoscere. In secondo luogo, garantendo nel contempo l'animale e ritraendo l'incisione, posizionamento ottimale per monitorare la respirazione e per assicurare che la trachea è libero di compressione è essenziale. Terzo, evitare schiacciamenti o allungamento del nervo vago, poiché ciò può causare variazioni della frequenza cardiaca con stimolazione vagale. In quarto luogo, poiché retrazione dell'ACI è necessario per controllare il sanguinamento durante l'arteriotomia, occorre prestare attenzione al grado di tensione durante la retrazione per evitare di danneggiare l'arteria. Se l'arteria non strappare dalla retrazione, o se v'è una scarsa un'incisione arteriotomia, l'animale deve essere escluso dall'analisi a causa del rischiodi emorragia e poveri riperfusione.
Modifiche e risoluzione di problemi
Usando MRI come guida, la lunghezza sutura può essere ottimizzato per garantire che la punta di silicone occlude correttamente la MCA per creare l'ischemia focale. Se la risonanza magnetica non è disponibile, i cuccioli possono essere eutanasia prima di riperfusione per la dissezione di visualizzare il posizionamento della sutura. Regolare la lunghezza della sutura come necessario. Il peso dei cuccioli altamente correlata con i requisiti di lunghezza occlusione sutura. Il tempo di occlusione può essere modificato per regolare il grado di gravità della lesione.
Inoltre, la forma e la lunghezza sutura sono critici. Per P10 ratti Sprague-Dawley e Long Evans pesatura 19-21 g 10 mm è la lunghezza ottimale di inserimento nella nostra esperienza. Ulteriore inserimento della sutura occlusione può causare perforazione del MCA. Inoltre, la coerenza nella forma del filamento di occlusione in ogni chirurgia si tradurrà in una maggiore consistenza del pregiudizio pattern 19, 20. Per questo motivo, si consiglia di utilizzare suture professionalmente realizzati per questo scopo specifico. E 'anche importante notare che il modello pregiudizio può variare tra gli operatori a causa delle differenze apparentemente minute a tecnica.
Limitazioni della tecnica
L'esecuzione di questa tecnica in un piccolo, lo sviluppo di roditore richiede esperienza significativa. Se eseguito correttamente, il chirurgo è in grado di causare un modello di lesioni molto coerente in tutti gli animali di diverse dimensioni e di raggiungere un tasso di sopravvivenza superiore al 95%. Inoltre, adeguati strumenti chirurgici sono essenziali. Gli strumenti chirurgici devono essere ben tenute a garantire che tutti i suggerimenti dello strumento si avvicinano in modo corretto.
Importanza di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti o alternativi
Mentre ipossia-ischemia, o il modello di Rice-Vannucci 2 </sup>, è più comunemente utilizzato per studiare danno ipossico-ischemico nel cervello in via di sviluppo, è importante notare che questo modello di tMCAO è distinto da HI a che non ci sia l'ischemia focale transitoria senza ipossia globale, seguita da una fase di riperfusione quando il ostruzione viene rimosso e il flusso di sangue viene ripristinato. Ciò causa una lesione più costante e riproducibile ed è più clinicamente traslazionale provocando un modello infortunio simile a quello osservato negli ictus neonatale a termine. In questo modo lo studio dei tipi di lesione focali e risposte compensatorie nel tessuto illeso.
Le future applicazioni Dopo aver imparato questa tecnica
Questo modello è simile alla causa più comune di ictus nei neonati umani, un trombo occlusivo transitorio che si verifica durante il periodo perinatale 11, 21. L'eziologia non è del tutto chiara ed è più probabile multifattoriale, ma si presume nella maggior parte dei casi to derivare da emboli passando dalla placenta 11. Inoltre, molti nati con ictus perinatale presunta spesso presenti con attività convulsiva entro o sottile esame neurologico focale Anomalie 22. Questo rende l'utilizzo di un modello di lesioni traslazionale coerente per identificare i meccanismi di progressione lesioni e le possibili strategie terapeutiche cruciali.
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the NIH K08 NS064094 and UCSF REAC grants. The authors would like to acknowledge Nikita Derguin, Zinalda Vexler, and Joel Faustino for their assistance in the development of this technique.
Isoflourane | Henry Schein | 50033 | anesthetic, at 3% |
Trinocular Surgioscope | World Precision Instruments | PSMT5N | |
Heating pad | Sunbeam | 000731-500-000 | low to medium setting |
IR Thermometer | Extech Instruments | 72-5270 | |
Retraction kit for small animals | Fine Science Tools | 18200-20 | |
CermaCut Scissors | Fine Science Tools | 14958-09 | |
Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 112522-00 | 2x |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2x |
B-2 Micro Clamp | Fine Science Tools | 00398-02 | |
Forcepts for Clamp Application | Fine Science Tools | 00072-14 | |
Micro Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2mm cutting edge |
Occlusion Sutures | Doccol | 602123PK10 | 701712PK5Re |
Ruler | Fine Science Tools | ||
Hemostatic Agent | Avitene | DVL1010590 | |
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture | Ethicon | 769G | |
Euthasol | Virbac | 710101 | 0.22 ml/kg |
Cotton Tipped Applicators | Henry Schein | 100-9249 | |
Laboratory Tape | VWR | 89097-990 |