ハイブリドーマ技術によってマウスモノクローナル抗体の作製
Summary
An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.
Abstract
Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.
Introduction
このプロトコルで提示されたハイブリドーマ技術は、最初のいくつかの技術的な改良を除いて、主な手順は最後の40年2の間に劇的に変化していない、1975年にケーラーとミルスタイン1によって説明しました。このプロトコルの目的は、より適切な免疫戦略、モノクローナル抗体の生成のための標準的な方法、および検証法（ELISA）のための一例を説明することです。
抗体は、信じられないほどのツールであり、そのようなフローサイトメトリー、磁気細胞選別、または免疫蛍光などの技術的アプローチ、の広い範囲、ならびに疾患のモニタリングおよび処置の3のための診断と治療法の選択肢に貢献しています。希望するターゲットのためのモノクローナル抗体の商業的利用可能性は、抗体または抗体関連製品4のほぼ無数の量と24以上の異なるウェブデータベースの存在によって証明されます。 2015年には、ntibody分子は、市販の抗体の適切な検証および特性評価に深刻な問題に起因する国際的な議論5-7の一部でした。
標的抗原に特異的な抗体を見つけることは困難かつ高価であり、多くの場合、それらは、親和性または特異性が必要ありません。抗体を生成することはまだ時間がかかり、かもしれない、より良いものを購入するよりも、個別の抗体を産生する、開発し、抗体を検証するために熟練した人材を必要としますが。
抗体産生は、時間がかかると経験を必要とするという事実のために、結合分子の産生のための代替的な方法は、これらの問題を克服するために開発されました。最も一般的に使用される別の方法は、ファージディスプレイを介して、単鎖抗体の組換え産生です。可変結合領域の遺伝子は、細胞から抽出されたファージの被覆タンパク質と組み合わされます。のイングル鎖は、次いで、バクテリオファージの表面に発現され、いくつかのパニングの工程8にスクリーニングされます。単鎖抗体の産生が少し高速であるが、それはまた、熟練した実験者を必要とします。いくつかの組換え単鎖抗体の欠点は、低い安定性およびインビトロ診断のための適合性の欠如です。ほとんどの診断テストでは、検出のためのFc受容体は、その後、組換え一本鎖抗体に付加する必要がある、必要です。再び、これは時間がかかり、ハイブリドーマ技術よりもさらに複雑です。 インビトロ診断では、完全長モノクローナルマウスおよびウサギ抗体が最良の選択であることが実証されています。
免疫複合体の設計を：研究室での作業を開始する前に、モノクローナル抗体を生成する際の主要なステップの一つが行われなければなりません。対処する必要のある質問は以下のとおりです。ターゲットの物理的組成物は、最終的なアプリケーションシートで何ですかイオン、及びその行列が存在していますか？どの濃度目標は、アプリケーションを持っているのだろうか？最終的なアプリケーションは何か、そして抗体が満たさなければならない要件は何ですか？
常に線形ペプチド断片が使用される場合、それはまた、選択の対象で最終エピトープに線形でなければならないことを考慮に入れます。そうしないと、抗体が結合しないであろう。もちろん、スクリーニング方法とは無関係に、抗体は、異なる用途における異なる抗原フォーマットを認識するように選択することができるが、これは非常に正確に検証されなければなりません。これらは、抗体開発と検証は、このような野心的なプロセスである理由です。
免疫のための抗原フォーマットの選択は、抗体開発のための基本であり、このプロセスの成功または失敗を決定します。マウスは、関連する抗体力価を発現した後、脾臓細胞を単離し、骨髄腫細胞と融合させます。以下のための最も一般的な骨髄腫細胞株マウスモノクローナル抗体の開発は、X63-Agの8.653 9およびBALB / cマウス株由来のSp2 / 0-Agの14 10です。細胞は、悪性B細胞リンパ腫から降りると、彼らは自分の重鎖または軽鎖のいずれかを分泌しないため、選択されました。 1（骨髄腫細胞対脾臓細胞）：細胞を1:10と10との間の比に適合させることができます。 Stoichevaとホイ11によれば、1及びポリエチレングリコール（PEG）及び電気融合により融合した。このプロトコールでは、細胞を3の比に適合させました。
B細胞とミエローマ細胞との融合は、ランダムなプロセスです。したがって、2つのBリンパ球または2骨髄腫細胞のハイブリッドを生成することができるが、これらの雑種は、培養中の長時間生存することができないだろう。細胞は、融合されたハイブリドーマ細胞を伴うピリミジン合成のデノボ経路を使用する可能性を生き残ることが可能なヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（HAT）選択を受けます。月の世代のためにoclonal抗体は、一つの母細胞に由来する細胞株を得ることが必要です。モノクローナル性希釈技術および細胞成長の顕微鏡分析を制限することによって保証されます。ハイブリドーマ培養上清は、主にELISAによって、特異的抗体産生についてスクリーニングまたはフローサイトメトリー、および最高の結合剤が選択されています。大量培養および精製の後、抗体分子は、最終的に特徴付けることができ、所望の用途のための検証します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ハイブリドーマ技術によってモノクローナル抗体の生成は、抗体が標的を認識しなければならないときに、特に最終的なアプリケーションに関しては、強烈かつ詳細なエピトープ分析を必要とします。これは、多くの場合、ユーザーが過小評価と弱いパフォーマンスには抗体につながります。融合プロセスは、特定のハイブリドーマの結果は、この時点で細胞比および活力に大きく依存する?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, “Artificial immune reactions,” “Camelid antibodies,” and “Antibody technologies.” We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.
Materials
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
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