הדור של Murine חד-שבטיים נוגדנים על ידי Hybridoma טכנולוגיה
Summary
An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.
Abstract
Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.
Introduction
הטכנולוגיה hybridoma שהוצגו בפרוטוקול זה תוארה לראשונה על ידי קוהלר ומילשטיין 1 בשנת 1975, למעט כמה שיפורים טכניים, ההליך העיקרי לא השתנה באופן דרמטי במהלך 40 השנים האחרונות 2. מטרת פרוטוקול זה היא להסביר אסטרטגית חיסון מתאימה יותר, שיטה סטנדרטית ההדורה של נוגדנים חד שבטיים, ודוגמא שיטת אימות (ELISA).
נוגדנים הם כלים מדהימים לתרום למגוון רחב של גישות טכנולוגיות, כגון cytometry זרימה, מיון תא מגנטי, או immunofluorescence, כמו גם אפשרויות אבחון וטיפול לניטור מחלה וטיפול 3. הזמינות המסחרית של נוגדנים חד שבטיים עבור מטרות רצויות מודגמת על ידי הנוכחות של מעל 24 מסדי נתוני אינטרנט שונים עם כמויות אינספור כמעט של נוגדנים או מוצרים הקשורים נוגדן 4. בשנת 2015,מולקולות ntibody היו חלק בדיון בינלאומי 5-7 בשל בעיות חמורות אימות נאה ואפיון של נוגדנים זמינים מסחרי.
זה יכול להיות קשה ויקר למצוא נוגדנים ספציפיים לנוגדן ממוקד, ולעתים קרובות, אין להם הזיקה או הסגולי צורכת. למרות שהניב נוגדן עדיין זמן רב ודורש כוח אדם מיומן לפתח ולאמת את הנוגדן, ייצור נוגדן בנפרד אולי טוב יותר מאשר לקנות אחד.
בשל העובדה כי ייצור נוגדנים הוא גוזל זמן ודורש ניסיון, שיטות חלופיות לייצור מולקולות מחייב פותחו כדי להתגבר על בעיות אלה. בשיטה החלופית הנפוצה ביותר היא ייצור רקומביננטי של נוגדנים חד-שרשרת באמצעות תצוגה הפאג. הגנים לאזור המחייב משתנה המחולצים תאים ובשילוב עם חלבון הציפוי של הפאג. ה- sשרשרת ingle מתבטאת אז על פני השטח של בקטריופאג ו הוקרנה בכמה פנורמי צעדים 8. הפקת נוגדנים חד שרשרת היא קצת יותר מהר, אבל זה גם דורש בניסויים מיומנים. החסרונות של כמה נוגדנים חד שרשרת רקומביננטי הם יציבות עניות וחוסר התאמת לאבחון במבחנה. ברוב הבדיקות דיאגנוסטי בנוסף קולטן Fc לגילוי יש צורך, אשר צריך להתווסף נוגדן חד שרשרת רקומביננטי לאחר מכן. שוב, זה זמן רבים עוד יותר מורכב מאשר טכניקת hybridoma. אבחון במבחנה, עכבר חד שבטי באורך מלא ונוגדני ארנב הוכחו להיות הבחירה הטובה ביותר.
אחד הצעדים המרכזיים ביצירת נוגדנים חד שבטיים חייב להיעשות לפני העבודה במעבדה מתחילה: העיצוב של immunoconjugate. שאלות שצריכות לטפל הן: מהו הרכב הפיזי של היעד הסופי מוצר היישוםיון, ואשר מטריצות נוכחות? איזה ריכוז יהיה היעד ביישום? מהו היישום הסופי, ומה הן הדרישות כי הנוגדן חייב למלא?
תמיד לקחת בחשבון שאם שבר פפטיד ליניארית משמש, זה גם צריך להיות ליניארי של epitope הסופי ביעד של בחירה; אחרת, הנוגדן לא יחייב. כמובן, ללא תלות בשיטת ההקרנה, נוגדנים יכולים להיבחר להכיר פורמטים אנטיגני שונים ביישומים שונים, אך זה חייב להיות מאומת בדיוק רב. אלו הן הסיבות מדוע פיתוח ותיקוף נוגדנים הם תהליכים כאלה שאפתנים.
הבחירה של פורמט אנטיגני לחיסון הוא בסיסי לפיתוח נוגדנים וקובע את ההצלחה או הכישלון של תהליך זה. לאחר העכברים להביע כיילו נוגדנים רלוונטיים, תאי הטחול מבודדים התמזגו עם תאי מיאלומה. שורות התאים מיאלומה הנפוצות ביותר עבורפיתוח נוגדנים חד שבטיים murine הם X63-Ag 8.653 9 ו- SP2 / 0-Ag 14 10 מתוך זן עכבר Balb / c. תאי צאצאים של לימפומה של תאי B ממאירים נבחרו כי הם לא מפרישים כל חלק מהרשתות קלות או כבד משלהם. התאים יכולים להיות מותאמים יחס בין 1:10 ו 10: 1 (splenocytes לעומת תאי מיאלומה). בפרוטוקול זה, התאים הותאמו יחס של 3: 1 ו התמזגו ידי פוליאתילן גליקול (PEG) ו electrofusion, על פי Stoicheva ו הואי 11.
השילוב של תאי B ותאי מיאלומה הוא תהליך אקראי. לכן, בני כלאיים של שני B לימפוציטים או שני תאי מיאלומה יכולים להיוצר, אבל אלה הכלאיים לא יוכל לשרוד במשך זמן רב בתרבות. התאים עוברים hypoxanthine, aminopterin, ו thymidine (HAT) בחירה, שבאמצעותו התמזגו רק תאי hybridoma יכולים לשרוד בשל האפשרות של שימוש במסלול דה נובו של סינתזת פירימידין. עבור הדור של monנוגדני oclonal, יש צורך להשיג קו תא שמקורם בתא אמא אחת. Monoclonality מובטחת על ידי הגבלת טכניקות דילול ואת הניתוח המיקרוסקופי של גדילת תא. את supernatants תרבות hybridoma מוקרנים על ייצור נוגדנים ספציפיים, בעיקר על ידי ELISA או cytometry זרימה, ואת קלסרים הטובים ביותר נבחרו. אחרי תרבות המונים וטיהור, מולקולת הנוגדן יכול סוף סוף להיות מאופיינת ומאומתת עבור היישום הרצוי.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדור של נוגדנים חד שבטיים ידי טכנולוגיית hybridoma דורש ניתוח epitope אינטנסיבי ומפורט, במיוחד בכל הנוגע ליישום הסופי, כאשר הנוגדן אמור לזהות את היעד. זה לזלזל לעתים קרובות על ידי משתמשים ומוביל נוגדנים עם הופעות חלשות. תהליך ההיתוך הוא תמיד אקראי, כלומר שתוצאת hybridomas הספציפי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, “Artificial immune reactions,” “Camelid antibodies,” and “Antibody technologies.” We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.
Materials
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 7 (256), 495-497 (1975).
- Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M., Böldicke, T. Antibodies and Selection. Protein Targeting Compounds. , 11-22 (2015).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks. Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).
- Pauly, D., Hanack, K. How to avoid pitfalls in antibody use. F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 5 (518), 27-29 (2015).
- Polakiewicz, R. D. Antibodies: The solution is validation. Nature. 26 (518), 483 (2015).
- Baker, M. Antibody anarchy: A call to order. Nature. 26 (527), 545-551 (2015).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).
- Shulman, M., Wilde, C. D., Köhler, G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature. 16 (276), 269-270 (1978).
- Stoicheva, N. G., Hui, S. W. Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol. J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).
- Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. Current developments in hybridoma technology. Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).
- Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes. Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).
- Holmes, P., Al-Rubeai, M. Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors. J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).
- Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells. Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).
- Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzlöhner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus. Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).
- Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins. neweramabs GmbH. , (2014).
