Generering av murina monoklonala antikroppar genom hybridomteknik
Summary
An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.
Abstract
Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.
Introduction
Tekniken hybridom som presenteras i detta protokoll beskrevs först av Köhler och Milstein en 1975 och, med undantag för vissa tekniska förbättringar, har huvudproceduren inte förändrats dramatiskt under de senaste 40 åren 2. Syftet med detta protokoll är att förklara en mer lämplig immunisering strategi, en standardmetod för generering av monoklonala antikroppar, och ett exempel för en valideringsmetod (ELISA).
Antikroppar är otroligt verktyg och bidra till ett brett spektrum av tekniska metoder, såsom flödescytometri, magnetisk cellsortering, eller immunofluorescens, samt diagnostiska och terapeutiska möjligheter för övervakning och behandling 3 sjukdom. Den kommersiella tillgängligheten av monoklonala antikroppar för önskade mål demonstreras av närvaron av över 24 olika webbdatabaser med nästan oräkneliga mängder av antikroppar eller antikroppsrelaterade produkter 4. År 2015, enntibody molekyler var en del av en internationell diskussion 5-7 på grund av allvarliga problem i korrekt validering och karaktärisering av kommersiellt tillgängliga antikroppar.
Det kan vara svårt och dyrt att hitta specifika antikroppar för en målinriktad antigen, och ofta, har de inte affiniteten eller specificiteten behövs. Även generera en antikropp är fortfarande tidsödande och kräver kunnig personal för att utveckla och validera antikroppen, som producerar en antikropp individuellt kanske bättre än att köpa en.
På grund av det faktum att antikroppsproduktion är tidskrävande och kräver erfarenhet, var alternativa metoder för produktion av bindande molekyler som utvecklats för att övervinna dessa problem. Den vanligast använda alternativ metod är rekombinant produktion av enkelkedjiga antikroppar via faguppvisning. Generna för den variabla bindningsregionen extraheras från celler och kombineras med beläggningsprotein av en fag. sIngle kedjan sedan uttrycks på ytan av en bakteriofag och screening i flera vaskningssteg 8. Produktion av enkelkedjiga antikroppar är lite snabbare, men det kräver också en skicklig experimentalist. Nackdelarna med vissa rekombinanta enkelkedjiga antikroppar är dålig stabilitet och brist på lämplighet för in vitro-diagnostik. I de flesta diagnostiska tester, är ett Fc-receptor för detektering krävs, som måste tillsättas till en rekombinant enkelkedjig antikropp efteråt. Återigen är detta tidskrävande och ännu mer komplext än hybridomtekniken. I in vitro-diagnostik, har full längd monoklonal mus- och kaninantikroppar visat sig vara det bästa valet.
En av de viktigaste stegen i att generera monoklonala antikroppar måste göras innan arbetet i labbet startar: utformningen av immunkonjugatet. Frågor som måste lösas är: Vad är den fysiska sammansättningen av målet i den slutliga applicatjon, och vilka matriser är närvarande? Vilken koncentration kommer målet har i ansökan? Vad är den slutliga ansökan, och vilka är de krav som antikroppen måste uppfylla?
tar alltid hänsyn till att om en linjär peptidfragment används, måste det också vara linjär i slut epitopen i målet val; annars kommer antikroppen inte binder. Naturligtvis, oberoende av screeningmetoden, antikroppar kan väljas för att känna igen olika antigena format i olika applikationer, men detta måste valideras mycket exakt. Dessa är skälen till antikroppsutveckling och validering är sådana ambitiösa processer.
Valet av antigena format för immunisering är grundläggande för utveckling av antikroppsläkemedel och bestämmer framgång eller misslyckande av denna process. När mössen uttrycker en relevant antikroppstiter ges mjältcellerna isolerades och fuserades med myelomceller. De vanligaste myelomcellinjer förmurin monoklonal antikroppsutveckling är X63-Ag 8,653 9 och Sp2 / 0-Ag 14 10 från en Balb / c-mus stam. Cellerna härstammar från en malign B-cell-lymfom och valdes ut eftersom de inte utsöndrar någon av sina egna tunga eller lätta kedjor. Cellerna kan anpassas till ett förhållande mellan 1:10 och 10: 1 (splenocyter kontra myelomceller). I detta protokoll ades cellerna anpassas till ett förhållande av 3: 1 och sammansmältes genom polyetylenglykol (PEG) och elektrofusion, enligt Stoicheva och Hui 11.
Fusion av B-celler och myelomceller är en slumpmässig process. Därför hybrider av två B-lymfocyter eller två myelomceller skulle kunna genereras, men de hybrider skulle inte kunna överleva under lång tid i odling. Cellerna genomgå en hypoxantin, aminopterin och tymidin (HAT) selektion, genom vilken endast fuserade hybridomcellerna kan överleva på grund av möjligheten att använda den vägen för pyrimidinsyntes de novo. För generering av månoclonal antikroppar, är det nödvändigt att erhålla en cellinje som härrör från en modercell. Den monoklonasäkerställs genom att begränsa utspädningstekniker och mikroskopisk analys av celltillväxt. De hybridomodlingssupernatanter screenas med avseende på specifik antikroppsproduktion, mestadels av ELISA eller flödescytometri, och de bästa bindemedlen är valda. Efter masskultur och rening, kan antikroppsmolekylen slutligen karaktäriseras och validerats för den önskade applikationen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genereringen av monoklonala antikroppar genom hybridomteknik kräver en intensiv och detaljerad epitop analys, särskilt när det gäller den slutliga tillämpningen, när antikroppen bör erkänna målet. Detta är ofta underskattas av användare och leder till antikroppar med svaga prestationer. Fusionsprocessen är alltid slumpmässigt, vilket innebär att resultatet av specifika hybridom är i hög grad beroende av cellförhållandet och vitaliteten vid denna punkt. Efter begränsad utspädning, cellerna är mycket …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, “Artificial immune reactions,” “Camelid antibodies,” and “Antibody technologies.” We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.
Materials
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 7 (256), 495-497 (1975).
- Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M., Böldicke, T. Antibodies and Selection. Protein Targeting Compounds. , 11-22 (2015).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks. Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).
- Pauly, D., Hanack, K. How to avoid pitfalls in antibody use. F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 5 (518), 27-29 (2015).
- Polakiewicz, R. D. Antibodies: The solution is validation. Nature. 26 (518), 483 (2015).
- Baker, M. Antibody anarchy: A call to order. Nature. 26 (527), 545-551 (2015).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).
- Shulman, M., Wilde, C. D., Köhler, G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature. 16 (276), 269-270 (1978).
- Stoicheva, N. G., Hui, S. W. Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol. J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).
- Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. Current developments in hybridoma technology. Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).
- Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes. Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).
- Holmes, P., Al-Rubeai, M. Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors. J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).
- Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells. Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).
- Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzlöhner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus. Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).
- Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins. neweramabs GmbH. , (2014).
