Высокая пропускная способность, в режиме реального времени, двойного считывания Тестирование внутриклеточного антимикробной активности и эукариотической клетки цитотоксичность

Summary

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Abstract

Традиционные меры внутриклеточного антимикробной активности и эукариотических клеток цитотоксичности полагаются на конечных анализов. Такие конечные точки анализы требуют несколько дополнительных экспериментальных шагов до начала считывания, такие как лизис клеток, определение элементарной колониеобразующих или добавления реагента. При выполнении тысячи анализов, например, во время высокопроизводительного скрининга, усилие вниз по течению, необходимое для этих типов анализов значительна. Поэтому, чтобы облегчить высокую пропускную способность противомикробное открытие, мы разработали анализ в режиме реального времени для одновременного идентификации ингибиторов внутриклеточного роста бактерий и оценки эукариотической клетки цитотоксичность. В частности, обнаружение внутриклеточный рост бактерий в режиме реального времени стало возможным благодаря маркировке бактериальных штаммов скрининга либо с бактериальным лк оперона (1 – ^е поколение) для анализа или флуоресцентный белок репортеров (2 – ^го поколения, ортогональным анализ). Нетоксичное, клеточная мембрана-impermeant, кислотно-связывающий краситель нуклеиновойТакже была добавлена ​​во время первичного инфицирования макрофагов. Эти красители исключаются из жизнеспособных клеток. Тем не менее, нежизнеспособные клетки-хозяева теряют целостность мембраны, разрешающий вход и флуоресцентного мечения ядерной ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты). Следует отметить, что связывание с ДНК связано с большим увеличением флуоресцентного квантовым выходом, который обеспечивает считывание решение на основе гибели клетки-хозяина. Мы использовали этот комбинированный анализ для выполнения экран высокой пропускной способностью в формате микропланшетов, а также для оценки внутриклеточного роста и цитотоксичности с помощью микроскопии. Следует отметить, что противомикробные может демонстрировать синергизм в которых комбинированное действие двух или более антимикробных при применении вместе больше, чем при применении по отдельности. Тестирование на синергии в пробирке против внутриклеточных патогенов , как правило, чудовищный задача , как должна быть оценена комбинаторные перестановками антибиотиков при различных концентрациях. Тем не менее, мы обнаружили, что наши в режиме реального времени анализа в сочетании с автоматизированной, цифровой технологии раздаточного рermitted легкое тестирование синергии. Используя эти подходы, мы были в состоянии систематически обследовать действие большого числа одних антимикробных и в сочетании с внутриклеточным патогеном, легионелл.

Introduction

Возбудители, которые растут или временно проживают в внутриклеточным трудно терапевтически искоренить. Облигатные или относительно облигатные внутриклеточные патогены , такие как легионелл, Coxiella burnetii, Brucella SPP. , Francisella tularensis и Mycobacterium SPP. часто требуют длительного курса антибактериальной терапии для лечения, которые могут варьироваться от нескольких месяцев до даже лет. Кроме того, внеклеточные патогены могут скоротечно занимают внутриклеточные ниши и таким образом избежать зазора обычными курсами антибактериальной терапии, а затем появляются, чтобы начать новые раунды вирулентных инфекции. Золотистый стафилококк ¹ и уропатогенные Enterobacteriaceae ^2,3 инфекции два все чаще признаются примеры. Таким образом, основной целью обнаружения наркотиков является выявление новых противомикробных препаратов, которые проникают во внутриклеточные отсеки. Оптимальная терапия быстро ликвидироватьвнутриклеточные микроорганизмы и предотвратить развитие резистентности через суб-ингибиторной антимикробного воздействия особенно желательно.

С этой целью мы разработали технологию высокопроизводительного скрининга для выявления внутриклеточных-пенетранта противомикробные препараты , нацеленные на внутриклеточный рост модели патогена, легионелл. ⁴ Предыдущие клинические наблюдения указывают на то, что стандартное тестирование чувствительность к антибиотикам не точно предсказать , в естественных условиях терапевтической эффективности против этого организма. ⁵ В частности, это произошло потому , что основные классы противомикробных , таких как бета-лактамов и аминогликозидов, хотя они весьма эффективны против axenically выращенного Legionella, не в достаточной степени проникают в внутриклеточные отсеки , где Legionella проживает. ^5,6 Впоследствии данные свидетельствуют о том, что технически более сложные анализы внутриклеточного роста эффективно предсказали клиническую эффективность. ⁷ </sup> К сожалению, эти анализы были чрезвычайно трудоемкие анализы конечных точек, требующих зараженных макрофаги, противомикробные препараты, чтобы быть лизируют в разное время точек для колониеобразующих единицы перечисления. Такие анализы являются непрактичными делать в больших масштабах и непригодны для обнаружения наркотиков с высокой пропускной способностью.

Таким образом, мы разработали технологию для определения в реальном времени внутриклеточного роста бактерий. ⁶ Это было достигнуто за счет использования бактериального штамма модифицированного путем интеграции либо бактериальной люциферазы оперон ⁸ (проба первого поколения, описанный ранее) ⁴ или флуоресцентный белок ⁹ репортеров (второго поколения, ортогональный анализе описано здесь) в бактериальную хромосому. Таким образом, люминесцентный или флуоресцентный сигнал обеспечивает заменяющим, в режиме реального времени отсчет бактериального числа.

Тем не менее, эти атрибуты не затрагивают основную confounder внутриклеточного infectioп анализы, вне цели воздействия на клетки-хозяева. В частности, гибель клетки-хозяина по своей сути ограничивает внутриклеточный рост и приводит к ложной положительной идентификации антимикробного эффекта. Поскольку многие соединения в библиотеках скрининга являются эукариотической клетки токсические, такие ложные срабатывания будут подавлять истинные противомикробные средства, что требует большого количества наблюдения, конечная точка цитотоксичности для разрешения.

Таким образом, это был большой интерес, чтобы быть в состоянии оценить жизнеспособность клеток эукариот и внутриклеточный рост одновременно. Следует отметить, что характеристика нежизнеспособных эукариотических клеток является потеря целостности клеточных мембран. Поэтому Зонды, которые проверяют проницаемость клеточной мембраны, могут быть использованы для оценки жизнеспособности клеток. Ранее мы охарактеризовали способность ряда предполагаемо клеточных мембран-impermeant, флуоресцентный, ДНК-связывающих красителей для доступа и окрашивает ядерную ДНК мертвых клеток. ⁴ При связывании ядерную ДНК, эти красители показывать значительное увеличение quantuм флуоресцентный выход приводит к увеличению сигнала над фоном раствора флуоресценции. Таким образом, эти красители при условии количественного считывания эукариотической клеточной гибели. ⁴ Следует отметить, что мы обнаружили , что некоторые были не токсичны сами по себе в течение длительного совместной инкубации с J774 макрофагами. При добавлении во время первичной инфекции, они обеспечили в режиме реального времени, флуоресцентный отсчет эукариотической клеточной смерти, которая может быть измерена с помощью микропланшет флуориметре или наблюдаемую микроскопически.

Таким образом, путем объединения использование бактериального репортера и нетоксичного, мембранная-impermeant, ДНК-связывающие красители, мы смогли разработать простой, неразрушающий, в режиме реального времени анализа для измерения как бактериальной нагрузки и эукариотической клетки цитотоксичность одновременно. Этот анализ позволил нам экран в 384-луночного формата пластины ~ 10000 известных биоактивных включая ~ 250 антимикробные и> 240000 малые молекулы с функционально неохарактеризованной активностью по способности ингибировать внутриклеточный ростЛегионелл, в то же время при создании эукариотических данных цитотоксичности для каждого соединения. ⁶ Наш анализ известных антимикробных против внутриклеточного роста легионелл был наиболее полное исследование этого типа на сегодняшний день. ⁶

На основе эффективности нашего формате анализа, мы также исследовали в дальнейшем потенциально синергетические эффекты известных антимикробных при использовании в комбинации. Одним из наиболее распространенных тестов синергии, так называемый шахматный анализ, Стандартно выполняется путем оценки комбинаторных эффектов двукратными серийными разведениями двух или более противомикробных препаратов. ¹⁰ В этих анализах, синергизм определяется наблюдением большего эффекта , когда два или более противомикробные препараты применяются вместе , чем сумма эффектов каждого применяемого отдельно. Следует отметить, что до сих пор, только целенаправленным и селективным тестирование синергии проводили против внутриклеточных легионелл </eм> из-за больших усилий, участвующих в традиционных конечных точек анализов, умноженное на комбинаторных перестановок требуется.

Для облегчения тестирования синергии, мы использовали наш реального времени внутриклеточного роста / эукариотической анализа на цитотоксичность в сочетании с автоматизированной цифровой технологией раздаточного ^6. Это автоматизации позволило нам обойтись серийных разведений соединений, растворенных в диметилсульфоксиде или в отдельности или в комбинации в виде 384-водного раствора. ¹¹ Кроме того, такая надежная технология жидкости обработка позволила нам легко выполнять более высокое разрешение, квадратного корня из двух (а не стандарт, более низкое разрешение, удвоение) комбинации разбавления для достижения более высоких уровней специфичности в нашем двумерная, в шахматном порядке синергии анализ. Это разрешение было особенно ценно в решении проблем в области синергии о воспроизводимости при использовании двукратном разбавлении серии ^12. И, наконец, наш анализ был количественным, а также TherEfore измеряется градаций торможения. В результате, анализ захватили полноту ингибиторной информации, экспрессируемый в isocontour isobolograms, в котором isocontours соединить комбинаторные концентрации с аналогичными уровнями ингибирования роста. ⁶ Эта стратегия позволила визуализировать построение комбинаторных кривых доза-ответ. Чтобы проиллюстрировать нашу методологию, мы описываем наш протокол для выполнения этих анализов и показывают репрезентативные результаты.

Protocol

1. в реальном масштабе времени внутриклеточный роста и эукариотической клетки цитотоксичности Подготовка клетки-хозяева (J774A.1 клетки) Культура J774A.1 Mus Musculus макрофагами , как клетки в суспензии в среде RPMI 1640 с 9% железа с добавкой сыворотки теленка. Первоначально канал в ку?…

Representative Results

Микропланшетов внутриклеточный анализ роста Рисунок 1 Схемы этапы анализа. Автоматизированные шаги, показанные могут быть выполнены вручную. Однако пропускная способность значительно облегчается с использованием жидких с?…

Discussion

Мы описываем анализы в режиме реального времени для одновременного обнаружения внутриклеточного роста бактерий и клетки-хозяина цитотоксичности. Есть несколько важных шагов в протоколе. Во-первых, для надежного проведения анализа, должно быть достаточным, спектральное разделение ме…

Materials

J774A.1 cells	American Type Culture Collection	TIB-67	Host cell
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Yeast extract, ultrafiltered	Becton-Dickinson/Difco	210929	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt	Sigma-Aldrich	K2000	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Potassium phosphate, dibasic	Thermo Fisher Scientific	P288-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C-7755	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Ammonium iron(III) citrate	Sigma-Aldrich	F5879	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately
Potassium hydroxide solution, concentrated	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Deonized water	N/A	N/A	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Thymidine (tissue culture grade)	Sigma-Aldrich	T1895	For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640
RPMI 1640, standard formulation	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 lacking phenol red	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration
Iron-supplemented calf serum	Gemini Bioproducts	100-510	For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.
GelRed, 10000X solution in water	Biotium	41003	For staining for J774A.1 cell death determination by epifluorescence microscopy (in conjunction with green fluorescent bacteria). Use Gel Red  at 1X final concentration.
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)
Orbital shaker	BellCo Glass	7744-01010	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)
Shaker flasks (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker flasks (1000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (1000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Sponge foam caps for flasks (250 ml – 1000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump	Thermo Fisher Scientific	5840300	For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes
Combi standard bore manifold	Thermo Fisher Scientific	24072670	Default predispense volume of 20 ml is insufficient to compensate for settling — increase to 80 ml
White 384 well dishes treated for tissue culture	Corning	3570	For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules)	Sigma-Aldrich	D2650	For dissolving positive control and test compounds
Azithromycin	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antibiotic positive control
Saponin (from Quillaja bark)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cytoxicity positive control
Multichannel pipettor	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette	For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing
Epson pin transfer robot	Epson/ICCB-L	(Custom equipment)	For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays
D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	D300	For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 microliters
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	For dispensing test compounds
EnVision multi-mode plate reader	Perkin-Elmer	(Contact manufacturer)	For optimal detection of SYTOX Green fluorescence, use excitation filter 485/14, emission filter 535/25, and dichroic mirror 505 nm, with selection of minimum gain and transmittance, and “high concentration mode. For luminescence detection, use the "USLUM" protocol for high-sensitivity detection. For mNeptune2 detection, use excitation filter 600/8, emission filter 665/7.5, and dichroic mirror 658 nm, with selection of gain and transmittance to achieve the highest maximum signal possible without saturating the photomultiplier.
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera	Nikon	Ti	For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution
Glass-bottom tissue culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.  These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.
Photoshop CS6	Adobe		Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.
Mathematica 10	Wolfam		For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.