תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

Summary

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Abstract

מדדים מסורתיים של פעילות מיקרוביאלית תאיים cytotoxicity תא אוקריוטים להסתמך על מבחני הסיום. מבחני הסיום כאלה דורשים כמה צעדים ניסיוניים נוספים לפני readout, כגון תמוגה התא, נחישות יחידת המושבה להרכיב, או בנוסף מגיב. בעת ביצוע אלף מבחנים, למשל, במהלך הקרנת תפוקה גבוהה, המאמץ במורד הזרם הנדרש עבור סוגים אלה של מבחנים הוא ניכר. לכן, כדי להקל על גילוי מיקרוביאלית תפוקה גבוה, פתחנו assay בזמן אמת לזהות מעכבים הזמניים של התפתחות חיידקים תאית ולהעריך cytotoxicity תא האיקריוטים. באופן ספציפי, זיהוי התפתחות חיידקים תאית בזמן האמת היה מופעל על ידי סימון זני הקרנה חיידקי גם עם אופרון לוקס בקטריאלי (1 assay דור ^st) או כתבי חלבון פלואורסצנטי (2 דור ^nd, assay המאונך). לצבוע רעיל, קרום התא-impermeant, חומצות גרעין מחייבגם נוסף במהלך הדבקה ראשונית של מקרופאגים. צבעים אלה אינם נכללים תאי קיימא. עם זאת, תאי מארחים לא-ישימים לאבד שלמות קרום המתיר כניסה וסימון ניאון של DNA הגרעיני (חומצת deoxyribonucleic). יש לציין, DNA כריכה קשור לעלייה גדולה תשואת קוונטים פלורסנט המספקת הודעת פתרון המבוסס על מות תא מארח. השתמשנו assay המשולב הזה לבצע מסך תפוקה גבוהה בפורמט microplate, ועל מנת להעריך את הצמיחה ואת cytotoxicity תאיים על ידי מיקרוסקופ. יש לציין, antimicrobials עשוי להפגין סינרגיה שבו ההשפעה המשולבת של שתיים או יותר antimicrobials כאשר מיושמים יחד עולה כאשר מיושמים בנפרד. בדיקת לסינרגיה במבחנה נגד פתוגנים תאיים היא בדרך כלל משימה אדירה כמו פרמוטציות קומבינטורית של אנטיביוטיקה בריכוזים שונים צריך להיבדק. עם זאת, מצאנו כי assay בזמן האמת שלנו בשילוב עם אוטומטיות, דיגיטלי מחלק הטכנולוגיה permitted בדיקות סינרגיה קליל. באמצעות גישות אלו, הצלחנו לסקור פעולה שיטתית של מספר רב של antimicrobials לבד או ביחד נגד הפתוגן התאי, pneumophila הלגיונלה.

Introduction

פתוגנים גדלים או מתגוררים באופן זמני בתאים תאיים קשים למגר טיפולי. לחייב או יחסית לחייב פתוגנים תאיים כגון pneumophila הלגיונלה, burnetii Coxiella, spp Brucella. Francisella, tularensis, ו spp Mycobacterium. לעתים קרובות דורשים ממושך קורסים של טיפול אנטי-מיקרוביאלי לריפוי כי עשוי לנוע בין חודשים ואף שנים. יתר על כן, פתוגנים תאיים עשויים זמני לכבוש נישות תאיות בדרך זו לברוח אישור על ידי קורסים רגילים של טיפול אנטי-מיקרוביאלי, ואחר כך יוצא להתחיל סיבובים חדשים של זיהום ארסי. Staphylococcus aureus ¹ וזיהומי uropathogenic ^2,3 Enterobacteriaceae הם שתי דוגמאות להכרה גוברת. לכן, מטרת גילוי תרופות בסיסית היא לזהות antimicrobials רומן חודרים לתאים תאיים. טיפול אופטימלי במהירות לבעראורגניזמים תאיים ולמנוע התפתחות של עמידות באמצעות חשיפה מיקרוביאלית תת-מעכבות במיוחד רצוי.

לשם כך, פתחנו טכנולוגית הקרנת תפוקה גבוהה לזהות antimicrobials תאי-penetrant מיקוד הצמיחה התאית של הפתוגן המודל, pneumophila הלגיונלה. ⁴ תצפיות קליניות קודמות עולות כי בדיקות רגישות מיקרוביאלית תקן לא לחזות במדויק יעילות טיפולית vivo נגד אורגניזם זה. באופן ספציפי ^5, זה היה בגלל סוגים עיקריים של antimicrobials כמו β-lactams ו אמינוגליקוזידים, למרות יעיל מאוד נגד axenically גדלה הלגיונלה, אינם חודרים מספיק לתוך התאים התאיים שבו הלגיונלה מתגורר. ^5,6 ראיות בהמשך הציעו טכני מורכבים יותר מבחני צמיחה תאית חזה יעילות קלינית ביעילות. ⁷ </sup> למרבה הצער, אלה מבחנים היו מבחני נקודות קצה מייגעים, מחייב מקרופאגים נגועים, שטופלו antimicrobials, להיות lysed בנקודות בזמנים שונים עבור ספירת יחידת מושבה להרכיב. מבחנים כאלה הם מעשי לעשות בקנה מידה גדולה והם מתאימים לגילוי סמי תפוקה גבוהה.

לכן, פתחנו טכנולוגיה לקביעה בזמן האמת של התפתחות חיידקים תאית. ⁶ הדבר זה הושג באמצעות שימוש זן חיידקים השונה באמצעות שילוב של אחת המעמד של חיידקים בלוציפראז אופרון ⁸ (assay הדור הראשון, שתואר לעיל) ⁴ או פלורסנט חלבון ⁹ עיתונאים (דור שני, assay המאונך, המתוארת כאן) לתוך כרומוזום החיידקים. בדרך זו, זורח או אות ניאון מספק פונדקאית, readout בזמן אמת של מספר חיידקים.

עם זאת, תכונות אלה לא להתייחס מתערבים מרכזיים infectio התאימבחני n, השפעות חוץ-היעד בתא הפונדקאי. בפרט, מותו של תא המארח מגביל מטבעו צמיחה תאית וגורם זיהוי חיובי כוזב של אפקט מיקרוביאלית. כמו תרכובות רבות בספריות הקרנה הן תאים איקריוטיים, רעילות תוצאות חיוביות שגויות כאלה היו להציף antimicrobials נכון, דבר מחייב מספר גדול של מעקב, מבחני cytotoxicity קץ לשם קבלת החלטה.

לכן, זה היה עניין רב כדי להיות מסוגל להעריך כדאיויות תא האיקריוטים וצמיחה תאית זמנית. יש לציין, מאפיין של תאים איקריוטיים הלא קיימא הוא הפגיעה בשלמות קרום התא. בדיקות הבודקים את החדירות של קרום התא עשוי אפוא לשמש כדי להעריך כדאיות התא. אנחנו שאפיינו את היכולת של סדרת-impermeant קרום התא putatively, ניאון, צבעים-DNA מחייבת לגשת להכתים DNA הגרעיני של תאים מתים. ⁴ ביום ה- DNA מחייב גרעינית, צבעים אלה מהווים גידול גדול quantuמ פלורסנט תשואה וכתוצאה מכך האות מוגברת על קרינת פתרון רקע. ככזה, צבעים אלה ספקו הודעה כמותי של מוות של תאים איקריוטיים. ⁴ יש לציין, מצאנו כי כמה היו רעילים עצמם במהלך שיתוף דגירה ממושכת עם מקרופאגים J774. כאשר נוספו במהלך הזיהום הראשוני, הם סיפקו בזמן אמת, ההודעה ניאון של מוות של תאים איקריוטיים שניתן למדוד על ידי fluorimeter microplate או שנצפה מיקרוסקופית.

לכן, על ידי שילוב של השימוש עיתונאי חיידקים ולא רעיל, קרום impermeant, צבעי ה- DNA מחייב, הצלחנו לפתח assay פשוט, שאינו הרסני, בזמן אמת כדי למדוד הן עומס חיידקים ו cytotoxicity תא אוקריוטים זמנית. assay זו אפשרה לנו להקרין בפורמט צלחת 384 גם ~ 10,000 bioactives ידוע כולל ~ 250 antimicrobials ו> 240,000 מולקולות קטנות עם פעילות uncharacterized מבחינה תפקודית עבור היכולת לעכב צמיחה תאית שלPneumophila הלגיונלה, בעוד באותו הזמן להפקת נתוני cytotoxicity התא אוקריוטים לכל מתחם. ⁶ הניתוח שלנו של antimicrobials הידוע מפני צמיחה תאית של הלגיונלה היה החקר המקיף ביותר מסוג זה עד כה. ⁶

בהתבסס על היעילות של פורמט assay שלנו, אנו ובהמשך גם בחנו את ההשפעות סינרגיסטי הפוטנציאלי של antimicrobials ידוע מתי להשתמש בשילוב. אחד המבחנים סינרגיה הנפוצים ביותר, assay שחמט שנקרא, מבוצע standardly ידי הערכת ההשפעות קומבינטורית של דילולים סדרתי כפולה של שניים או יותר antimicrobials. ¹⁰ מבחנים אלה, סינרגיה מוגדרת על ידי התצפית של השפעה גדולה יותר כאשר שתיים או יותר antimicrobials מוחלים יחד מסכום ההשפעות של כל מיושמות בנפרד. מן ראוי לציין כי, עד כה, התמקד רק ובדיקת סינרגיה סלקטיבית בוצעה נגד pneumophila הלגיונלה התאי </em> בגלל מאמץ הרב טמון מבחני סיום מסורתיים מוכפלים פרמוטציות קומבינטורית הנדרשת.

כדי לאפשר בדיקת סינרגיה, עשינו שימוש הצמיחה תאית בזמן האמת שלנו / assay cytotoxicity איקריוטיים בשילוב עם טכנולוגיה מחלק דיגיטלית אוטומטית ^6. אוטומציה זה מותר לנו לוותר דילולי סדרה של תרכובות המומסות DMSO או בתמיסה מימית לבד או בשילוב בפורמט 384 גם. ¹¹ יתר על כן, טכנולוגית טיפול נוזל חזקה כאלה מותר לנו לבצע ברזולוציה גבוהה יותר בקלות, שורש ריבועי-של-שני (ולא סטנדרטי, רזולוציה נמוכה יותר, הכפלה) שילובי דילול להשיג רמות גבוהות יותר של סגוליות בסינרגיה דו הממדים, שחמט שלנו אָנָלִיזָה. החלטה זו הייתה יקרה במיוחד מענה לחששות בתחום סינרגיה על שחזור בעת שימוש סדרת דילול הכפול ^12. לבסוף, assay שלנו הוא כמותי וגם יסefore נמדד דרגות של עיכוב. כתוצאה מכך, assay כבש את מכלול המידע מעכב, שבא לידי ביטוי isobolograms isocontour שבו isocontours להתחבר ריכוזים קומבינטורית עם רמות דומות של עיכוב צמיחה. ⁶ זה אסטרטגיה והתוויית מותרת להדמיה של עקומות קומבינטורית מנה-תגובה. כדי להמחיש המתודולוגיה שלנו, אנו מתארים הפרוטוקול שלנו לביצוע מבחנים אלה ולהציג תוצאות נציג.

Protocol

1. צמיחה התאית Real Time ו Assay Cytotoxicity Cell איקריוטיים תאי מארח הכנה (תאי J774A.1) תרבות J774A.1 תאי מקרופאג דמוי musculus Mus ההשעיה ב RPMI 1640 עם 9% נסיוב עגל-בתוספת ברזל. בתחילה מעבר צלוחי?…

Representative Results

assay צמיחה התאי microplate איור 1 דיאגרמות הצעדים assay. השלבים האוטומטיים לראות יכולים להתבצע באופן ידני. עם זאת, התפוקה היא הקל מאוד באמצעות מערכות טיפול נוזליות. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-…

Discussion

אנו מתארים מבחנים בזמן אמת עבור זיהוי סימולטני של התפתחות חיידקים תאית cytotoxicity תא מארח. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, עבור ביצועים assay חזקים, חייבת להיעשות הפרדה ספקטרלי מספיק בין readouts חיידקים cytotoxicity. הפרדה כזו היא חלק מובנה עבור שילובים של כתבים אופרון בל?…

Materials

J774A.1 cells	American Type Culture Collection	TIB-67	Host cell
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Yeast extract, ultrafiltered	Becton-Dickinson/Difco	210929	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt	Sigma-Aldrich	K2000	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Potassium phosphate, dibasic	Thermo Fisher Scientific	P288-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C-7755	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Ammonium iron(III) citrate	Sigma-Aldrich	F5879	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately
Potassium hydroxide solution, concentrated	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Deonized water	N/A	N/A	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Thymidine (tissue culture grade)	Sigma-Aldrich	T1895	For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640
RPMI 1640, standard formulation	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 lacking phenol red	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration
Iron-supplemented calf serum	Gemini Bioproducts	100-510	For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.
GelRed, 10000X solution in water	Biotium	41003	For staining for J774A.1 cell death determination by epifluorescence microscopy (in conjunction with green fluorescent bacteria). Use Gel Red  at 1X final concentration.
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)
Orbital shaker	BellCo Glass	7744-01010	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)
Shaker flasks (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker flasks (1000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (1000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Sponge foam caps for flasks (250 ml – 1000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump	Thermo Fisher Scientific	5840300	For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes
Combi standard bore manifold	Thermo Fisher Scientific	24072670	Default predispense volume of 20 ml is insufficient to compensate for settling — increase to 80 ml
White 384 well dishes treated for tissue culture	Corning	3570	For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules)	Sigma-Aldrich	D2650	For dissolving positive control and test compounds
Azithromycin	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antibiotic positive control
Saponin (from Quillaja bark)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cytoxicity positive control
Multichannel pipettor	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette	For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing
Epson pin transfer robot	Epson/ICCB-L	(Custom equipment)	For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays
D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	D300	For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 microliters
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	For dispensing test compounds
EnVision multi-mode plate reader	Perkin-Elmer	(Contact manufacturer)	For optimal detection of SYTOX Green fluorescence, use excitation filter 485/14, emission filter 535/25, and dichroic mirror 505 nm, with selection of minimum gain and transmittance, and “high concentration mode. For luminescence detection, use the "USLUM" protocol for high-sensitivity detection. For mNeptune2 detection, use excitation filter 600/8, emission filter 665/7.5, and dichroic mirror 658 nm, with selection of gain and transmittance to achieve the highest maximum signal possible without saturating the photomultiplier.
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera	Nikon	Ti	For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution
Glass-bottom tissue culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.  These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.
Photoshop CS6	Adobe		Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.
Mathematica 10	Wolfam		For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.