उच्च throughput, वास्तविक समय, intracellular रोगाणुरोधी गतिविधि के दोहरे readout परीक्षण और यूकेरियोटिक सेल cytotoxicity
Summary
A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.
Abstract
intracellular रोगाणुरोधी गतिविधि और यूकेरियोटिक सेल cytotoxicity के पारंपरिक उपायों समापन बिंदु assays पर भरोसा करते हैं। इस तरह के समापन बिंदु assays कई अतिरिक्त प्रयोगात्मक readout करने से पहले ऐसी सेल, कॉलोनी बनाने इकाई दृढ़ संकल्प, या अभिकर्मक अतिरिक्त के रूप में कदम है, आवश्यकता होती है। जब assays के हजारों प्रदर्शन, उदाहरण के लिए, उच्च throughput स्क्रीनिंग के दौरान, नीचे की ओर assays के इन प्रकार के लिए आवश्यक प्रयास काफी है। इसलिए, उच्च throughput रोगाणुरोधी खोज की सुविधा के लिए, हम एक वास्तविक समय परख एक साथ intracellular बैक्टीरिया विकास के अवरोधकों की पहचान करने और यूकेरियोटिक सेल cytotoxicity आकलन करने के लिए विकसित की है। विशेष रूप से, वास्तविक समय intracellular बैक्टीरिया विकास का पता लगाने के लिए या तो एक जीवाणु लक्स ओपेरोन (1 सेंट पीढ़ी परख) या फ्लोरोसेंट प्रोटीन संवाददाताओं (2 एन डी पीढ़ी, orthogonal परख) के साथ बैक्टीरियल स्क्रीनिंग उपभेदों अंकन रूप से सक्षम किया गया था। एक गैर विषैले, कोशिका झिल्ली-impermeant, न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी डाईयह भी मैक्रोफेज के आरंभिक संक्रमण के दौरान जोड़ा गया है। इन रंगों व्यवहार्य कोशिकाओं से बाहर रखा गया है। हालांकि, अलाभकारी मेजबान कोशिकाओं की झिल्ली अखंडता प्रवेश और परमाणु डीएनए के फ्लोरोसेंट लेबलिंग (deoxyribonucleic एसिड) की अनुमति देने खो देते हैं। विशेष रूप से, डीएनए बाध्यकारी फ्लोरोसेंट क्वांटम उपज है कि मेजबान कोशिका मृत्यु का एक समाधान आधारित readout प्रदान करता है में एक बड़ी वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है। हम इस संयुक्त परख का इस्तेमाल किया है microplate प्रारूप में एक उच्च throughput स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए, और माइक्रोस्कोपी द्वारा intracellular विकास और cytotoxicity आकलन करने के लिए। विशेष रूप से, antimicrobials तालमेल जिसमें दो या अधिक antimicrobials के संयुक्त प्रभाव जब एक साथ लागू किया जब अलग से लागू की तुलना में अधिक है प्रदर्शन कर सकते हैं। Intracellular रोगजनकों के खिलाफ इन विट्रो तालमेल के लिए परीक्षण सामान्य रूप से एक विलक्षण कार्य के रूप में अलग अलग मात्रा में एंटीबायोटिक दवाओं के मिश्रित क्रमपरिवर्तन का आकलन किया जाना चाहिए। हालांकि, हमने पाया है कि हमारे वास्तविक समय परख स्वचालित, डिजिटल वितरण प्रौद्योगिकी पी के साथ संयुक्तसतही तालमेल परीक्षण ermitted। इन तरीकों का उपयोग करना, हम व्यवस्थित intracellular रोगज़नक़, लीजोनेला pneumophila के खिलाफ अकेले antimicrobials की एक बड़ी संख्या की कार्रवाई और संयोजन में सर्वेक्षण करने में सक्षम थे।
Introduction
रोगज़नक़ों कि बढ़ने या intracellular डिब्बों में अस्थाई रूप से निवास कर उपचारात्मक उन्मूलन के लिए मुश्किल हो जाता है। लाचार या अपेक्षाकृत ऐसी लीजोनेला pneumophila, Coxiella burnetii, ब्रूसिला एसपीपी के रूप में intracellular रोगजनकों लाचार। , Francisella tularensis, और माइकोबैक्टीरियम एसपीपी। अक्सर इलाज है कि महीने के लिए भी साल से लेकर कर सकते हैं के लिए लंबे समय तक रोगाणुरोधी चिकित्सा के पाठ्यक्रम की आवश्यकता। इसके अलावा, बाह्य रोगजनकों क्षणिक intracellular आलों पर कब्जा कर सकते हैं और इस तरह से रोगाणुरोधी चिकित्सा के सामान्य पाठ्यक्रम से क्लीयरेंस बचने के लिए और बाद में उग्र संक्रमण के नए दौर शुरू करने के लिए उभरेगा। स्ताफ्य्लोकोच्चुस 1 और uropathogenic Enterobacteriaceae 2,3 के संक्रमण तेजी से मान्यता प्राप्त दो उदाहरण हैं। इसलिए, एक मौलिक दवाओं की खोज के लक्ष्य उपन्यास antimicrobials कि intracellular डिब्बों में घुसना की पहचान है। इष्टतम चिकित्सा जल्दी से उन्मूलन करने के लिएintracellular जीवों और उप निरोधात्मक रोगाणुरोधी प्रतिरोध के माध्यम से जोखिम के विकास को रोकने के लिए विशेष रूप से वांछनीय है।
यह अंत करने के लिए, हम मॉडल रोगज़नक़, लीजोनेला pneumophila के intracellular वृद्धि का लक्ष्य रखा intracellular-व्याप्ति antimicrobials पहचान करने के लिए एक उच्च throughput स्क्रीनिंग तकनीक विकसित की है। 4 पिछला नैदानिक टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि मानक रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण सही इस जीव के खिलाफ विवो चिकित्सीय प्रभावकारिता में भविष्यवाणी नहीं था। 5 विशेष रूप से, इस वजह से इस तरह के β लाक्टाम्स और aminoglycosides रूप antimicrobials के प्रमुख वर्गों, हालांकि axenically उगाया लीजोनेला के खिलाफ अत्यधिक प्रभावी, पर्याप्त intracellular डिब्बों जहां लीजोनेला रहता में घुसना नहीं है। 5,6 बाद में सबूत सुझाव दिया है कि तकनीकी रूप से और अधिक जटिल intracellular विकास assays प्रभावी रूप से नैदानिक प्रभावकारिता की भविष्यवाणी की। 7 </sup> दुर्भाग्य से, इन assays बेहद श्रमसाध्य समापन assays, संक्रमित मैक्रोफेज, antimicrobials के साथ इलाज की आवश्यकता होती कॉलोनी बनाने इकाई गणन के लिए अलग अलग समय बिंदुओं पर lysed जा रहे थे। ऐसे assays एक बड़े पैमाने पर करने के लिए अव्यावहारिक है और उच्च throughput दवाओं की खोज के लिए अनुपयुक्त हैं।
इसलिए, हम intracellular बैक्टीरिया विकास की वास्तविक समय निर्धारण के लिए प्रौद्योगिकी विकसित की है। 6 यह जीवाणु गुणसूत्र में 9 संवाददाताओं (दूसरी पीढ़ी, orthogonal परख, यहाँ वर्णित) या तो एक जीवाणु luciferase operon 8 के एकीकरण के माध्यम से संशोधित एक जीवाणु तनाव के उपयोग के माध्यम से पूरा किया गया (पहली पीढ़ी परख पहले से वर्णित,) 4 या फ्लोरोसेंट प्रोटीन। इस तरह, luminescent या फ्लोरोसेंट संकेत एक सरोगेट, वास्तविक समय बैक्टीरियल नंबर के readout प्रदान करता है।
हालांकि, इन विशेषताओं intracellular infectio में एक प्रमुख confounder का पता नहींn assays, मेजबान कोशिकाओं पर बंद लक्ष्य प्रभाव। विशेष रूप से, मेजबान सेल की मौत स्वाभाविक intracellular विकास को सीमित करता है और रोगाणुरोधी प्रभाव की झूठी सकारात्मक पहचान के लिए होता है। स्क्रीनिंग के पुस्तकालयों के रूप में कई यौगिकों यूकेरियोटिक सेल विषाक्त, इस तरह की झूठी सकारात्मक सच antimicrobials डूब जाएगा, अनुवर्ती, समाधान के लिए समापन बिंदु cytotoxicity assays की एक बड़ी संख्या की जरूरत महसूस कर रहे हैं।
इस प्रकार, यह बहुत रुचि के साथ ही साथ यूकेरियोटिक सेल व्यवहार्यता और intracellular विकास का आकलन करने में सक्षम हो। विशेष रूप से, अलाभकारी कोशिकाओं की एक विशेषता कोशिका झिल्ली अखंडता का नुकसान हुआ है। जांच जो कोशिका झिल्ली की पारगम्यता परीक्षण इसलिए सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम पहले से पहुँच सकते हैं और मृत कोशिकाओं के परमाणु डीएनए दाग कथित कोशिका झिल्ली-impermeant, फ्लोरोसेंट, डीएनए बाध्यकारी रंगों की एक श्रृंखला की क्षमता होती है। 4 परमाणु डीएनए बाध्यकारी पर, इन रंगों quantu में एक बड़ी वृद्धि प्रदर्शितएम फ्लोरोसेंट उपज पृष्ठभूमि समाधान प्रतिदीप्ति से अधिक बढ़ संकेत हो जाती है। जैसे, इन रंगों यूकेरियोटिक कोशिका मृत्यु का एक मात्रात्मक readout प्रदान की है। 4 विशेष रूप से, हमने पाया कि कई J774 मैक्रोफेज के साथ लंबे समय तक सह ऊष्मायन के दौरान गैर विषैले स्वयं थे। जब आरंभिक संक्रमण के दौरान कहा, वे एक वास्तविक समय, यूकेरियोटिक कोशिका मृत्यु के फ्लोरोसेंट readout कि एक microplate fluorimeter से मापा जा सकता है या मनाया microscopically प्रदान की है।
इसलिए, एक जीवाणु पत्रकार और गैर विषैले, झिल्ली impermeant के उपयोग के संयोजन से, डीएनए बाध्यकारी रंजक, हम एक सरल, गैर विनाशकारी, वास्तविक समय दोनों बैक्टीरियल लोड और यूकेरियोटिक सेल cytotoxicity एक साथ मापने के लिए परख विकसित करने में सक्षम थे। इस परख हमें 384 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में के intracellular विकास को बाधित करने की क्षमता के लिए जाना जाता है ~ 10,000 bioactives 250 antimicrobials और कार्यात्मक uncharacterized गतिविधि के साथ> 240,000 छोटे अणुओं स्क्रीन करने सहित ~ अनुमति दी गई हैलीजोनेला pneumophila, जबकि एक ही समय में प्रत्येक परिसर के लिए यूकेरियोटिक सेल cytotoxicity डेटा पैदा होता है। 6 लीजोनेला के intracellular वृद्धि के खिलाफ जाना जाता antimicrobials के हमारे विश्लेषण तिथि करने के लिए इस प्रकार का सबसे व्यापक अन्वेषण था। 6
हमारे परख प्रारूप की दक्षता के आधार पर, हम भी बाद में जाना जाता antimicrobials के संभावित synergistic प्रभाव जब संयोजन में इस्तेमाल का पता लगाया। सबसे आम तालमेल परीक्षणों में से एक है, तथाकथित बिसात परख, standardly दो या अधिक antimicrobials की दो गुना धारावाहिक dilutions का मिश्रित प्रभाव का आकलन करने के द्वारा किया जाता है। 10 इन assays में तालमेल अधिक से अधिक प्रभाव के अवलोकन से परिभाषित किया गया जब दो या अधिक antimicrobials प्रत्येक के प्रभाव को अलग से लागू की राशि से एक साथ लागू कर रहे है। ध्यान से, पहले, केवल केंद्रित है और चयनात्मक तालमेल परीक्षण intracellular लीजोनेला pneumophila के खिलाफ प्रदर्शन किया गया था </eM> महान मिश्रित आवश्यक क्रमपरिवर्तन से गुणा परंपरागत समापन बिंदु assays में शामिल प्रयास की वजह से।
तालमेल के परीक्षण की सुविधा के लिए, हम स्वचालित डिजिटल वितरण प्रौद्योगिकी 6 के साथ संयोजन में हमारी वास्तविक समय intracellular विकास / यूकेरियोटिक cytotoxicity परख का इस्तेमाल किया। यह स्वचालन DMSO या जलीय समाधान अकेले या 384 अच्छी तरह प्रारूप में संयोजन में में भंग यौगिकों के धारावाहिक dilutions बांटना करने के लिए हमें की अनुमति दी। 11 इसके अलावा, इस तरह के मजबूत तरल से निपटने प्रौद्योगिकी हमें की अनुमति दी आसानी से उच्च संकल्प प्रदर्शन करने के लिए, वर्ग-जड़-ऑफ-दो (बल्कि मानक की तुलना में, कम संकल्प, दोहरीकरण) कमजोर पड़ने संयोजन हमारे दो आयामी में विशिष्टता के उच्च स्तर को प्राप्त करने के लिए, बिसात तालमेल विश्लेषण। यह संकल्प reproducibility के बारे में तालमेल क्षेत्र में चिंताओं के समाधान में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब दो गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला 12 का उपयोग कर रहा था। अन्त में, हमारे परख मात्रात्मक और भी वहाँ थाefore निषेध की ग्रेडेशन मापा। नतीजतन, परख निरोधात्मक जानकारी की सम्पूर्णता, isocontour isobolograms में व्यक्त जिसमें isocontours विकास निषेध के समान स्तर के साथ मिश्रित सांद्रता कनेक्ट कब्जा कर लिया। 6 यह साजिश रचने रणनीति की अनुमति दी मिश्रित खुराक प्रतिक्रिया घटता के दृश्य। हमारे कार्यप्रणाली का उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए, हम इन assays के प्रदर्शन के लिए हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन है और प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम intracellular बैक्टीरिया विकास और मेजबान सेल cytotoxicity के एक साथ पता लगाने के लिए वास्तविक समय assays का वर्णन है। वहाँ प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। सबसे पहले, मजबूत परख प्रदर्शन के लिए, वहाँ बैक्टीरियल ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अनुसंधान इस पांडुलिपि में सूचना के तहत पुरस्कार नंबर R01AI099122 एलर्जी और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया JEK करने के लिए सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता स्वास्थ्य। हम ICCB-लांगवुड स्क्रीनिंग सुविधा और / या के लिए राष्ट्रीय जांच प्रयोगशाला से जेनिफर स्मिथ, डेविड Wrobel, र चियांग, डौग बाढ़, शॉन जॉनसन, जेनिफर Nale, स्टीवर्ट Rudnicki, पॉल यान, रिचर्ड सिउ, और राहेल वार्डन का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं न्यू इंग्लैंड क्षेत्रीय उत्कृष्टता के केंद्र में Biodefense और विकास और उच्च throughput स्क्रीनिंग assays के प्रदर्शन में उनकी सहायता के लिए संक्रामक रोग (U54AI057159 द्वारा समर्थित) उभर रहा है। हम यह भी पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी के लिए केनेथ पी स्मिथ को धन्यवाद देना चाहूंगा।
Materials
| J774A.1 cells | American Type Culture Collection | TIB-67 | Host cell |
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Yeast extract, ultrafiltered | Becton-Dickinson/Difco | 210929 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors |
| Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt | Sigma-Aldrich | K2000 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Potassium phosphate, dibasic | Thermo Fisher Scientific | P288-500 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C-7755 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Ammonium iron(III) citrate | Sigma-Aldrich | F5879 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately |
| Potassium hydroxide solution, concentrated | Thermo Fisher Scientific | SP236-500 | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Deonized water | N/A | N/A | For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium |
| Thymidine (tissue culture grade) | Sigma-Aldrich | T1895 | For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640 |
| RPMI 1640, standard formulation | Corning via Thermo Fisher Scientific | 10-040-CV | For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine |
| RPMI 1640 lacking phenol red | Corning via Thermo Fisher Scientific | 17-105-CV | For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use |
| L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade) | HyClone via Thermo Fisher Scientific | SH30034.02 | For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration |
| Iron-supplemented calf serum | Gemini Bioproducts | 100-510 | For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density |
| SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific | S7020 | For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration. |
| GelRed, 10000X solution in water | Biotium | 41003 | For staining for J774A.1 cell death determination by epifluorescence microscopy (in conjunction with green fluorescent bacteria). Use Gel Red at 1X final concentration. |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-255-26 | For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead) |
| Orbital shaker | BellCo Glass | 7744-01010 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately) |
| Shaker flasks (250 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-2038-04 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Shaker clamps for flasks (250 ml) | BellCo Glass | 7744-16250 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Shaker flasks (1000 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-2038-07 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Shaker clamps for flasks (1000 ml) | BellCo Glass | 7744-16100 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection |
| Sponge foam caps for flasks (250 ml – 1000 ml) | ChemGlass Life Sciences | CLS-1490-038 | For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps |
| MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes |
| Combi standard bore manifold | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | Default predispense volume of 20 ml is insufficient to compensate for settling — increase to 80 ml |
| White 384 well dishes treated for tissue culture | Corning | 3570 | For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully |
| DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules) | Sigma-Aldrich | D2650 | For dissolving positive control and test compounds |
| Azithromycin | Sigma-Aldrich | PHR1088 | Antibiotic positive control |
| Saponin (from Quillaja bark) | Sigma-Aldrich | S-4521 | Cytoxicity positive control |
| Multichannel pipettor | Thermo Fisher Scientific | Finnpipette | For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing |
| Epson pin transfer robot | Epson/ICCB-L | (Custom equipment) | For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays |
| D300 digital dispensing system | Hewlett-Packard via Tecan | D300 | For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 microliters |
| T8+ cartridges for D300 digital dispensing system | Hewlett-Packard via Tecan | T8+ | For dispensing test compounds |
| EnVision multi-mode plate reader | Perkin-Elmer | (Contact manufacturer) | For optimal detection of SYTOX Green fluorescence, use excitation filter 485/14, emission filter 535/25, and dichroic mirror 505 nm, with selection of minimum gain and transmittance, and “high concentration mode. For luminescence detection, use the "USLUM" protocol for high-sensitivity detection. For mNeptune2 detection, use excitation filter 600/8, emission filter 665/7.5, and dichroic mirror 658 nm, with selection of gain and transmittance to achieve the highest maximum signal possible without saturating the photomultiplier. |
| Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera | Nikon | Ti | For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution |
| Glass-bottom tissue culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope. These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms. |
| Photoshop CS6 | Adobe | Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images. | |
| Mathematica 10 | Wolfam | For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms. |
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