Høy gjennomstrømning, Real-time, Dual-avlesning Testing av intracellulær antimikrobiell aktivitet og eukaryote celle Cytotoksisitet

Summary

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Abstract

Tradisjonelle målinger av intracellulært antimikrobiell aktivitet og eukaryot celle cytotoksisitet stole på endepunkt analyser. Slike endepunkt assays krever flere andre eksperimentelle trinn før avlesning, slik som cellelyse, kolonidannende enhet bestemmelse, eller reagens tilsetning. Ved utførelse av tusenvis av analyser, for eksempel under high-throughput screening, nedstrøms innsats som er nødvendig for slike analyser er stor. Derfor, for å lette high-throughput antimikrobielle oppdagelse, har vi utviklet en sanntids analyse for samtidig å identifisere inhibitorer av intracellulær bakterievekst og vurdering eukaryot celle cytotoksisitet. Spesielt ble sanntid intracellulær bakterievekst gjenkjenning aktivert ved å markere bakterie screening stammer med enten en bakteriell lux operon (1 ^st generasjon analyse) eller fluoriserende protein journalister ^(2. generasjon, ortogonal assay). En ikke-toksisk, cellemembran-impermeant, nukleinsyre-bindende fargestoffDet ble også lagt under første infeksjon av makrofager. Disse fargestoffer er utelukket fra levedyktige celler. Men ikke-levedyktige vertsceller mister membran integritet tillater oppføring og fluorescerende merking av nukleært DNA (deoksyribonukleinsyre). Spesielt, DNA-binding er forbundet med en stor økning i fluorescerende kvantumutbyttet som gir en løsning basert på avlesning av verts celledød. Vi har brukt denne kombinerte analyse for å utføre en high-throughput-skjermen i mikroplateformat, og å vurdere intracellulær vekst og cytotoksisitet ved mikroskopi. Spesielt, kan antibiotika demonstrere synergi i hvilken den kombinerte virkning av to eller flere antimikrobielle midler når de anvendes sammen er større enn når det anvendes separat. Testing for in vitro synergi mot intracellulære patogener er normalt en uhyre oppgave som kombinatoriske permutasjoner av antibiotika ved forskjellige konsentrasjoner må vurderes. Men vi fant ut at vår sanntid analyse kombinert med automatisert, digital dispensering teknologi permitted lettvinte synergi testing. Ved hjelp av disse metodene, var vi i stand til å systematisk kartlegge virkningen av et stort antall antimikrobielle midler alene og i kombinasjon mot intracellulære patogener, Legionella pneumophila.

Introduction

Patogener som vokser eller bor midlertidig i intracellulære er vanskelig å terapeutisk utrydde. Forplikte eller relativt obligate intracellulære patogener som Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp. , Francisella tularensis, og Mycobacterium spp. ofte krever langvarig kurs av antimikrobiell behandling for kur som kan variere fra måneder til og med år. Videre kan ekstracellulære patogener forbigående oppta intracellulære nisjer og på denne måten unngå en avklaring av normale kurs av antimikrobiell behandling og senere komme til å starte nye runder med virulent infeksjon. Staphylococcus aureus ¹ og uropathogenic Enterobacteriaceae ^2,3 infeksjoner er to stadig mer anerkjente eksempler. Derfor er en grunnleggende medisiner som mål å identifisere nye antimikrobielle stoffer som trenger inn i intracellulære rom. Optimal behandling for raskt å utryddeintracellulære organismer og forebygge utvikling av resistens gjennom sub-hemmende antimikrobielle eksponering er spesielt ønskelig.

For å oppnå dette, har vi utviklet en high-throughput screening teknologi for å identifisere intracellulære-penetrerende antimikrobielle midler rettet mot intracellulære veksten av modellen patogen, Legionella pneumophila. ⁴ Tidligere kliniske observasjoner tyder på at standard antimikrobiell resistenstesting ikke nøyaktig forutsi in vivo terapeutisk effekt mot denne organismen. ⁵ Spesielt var dette fordi store klasser av antimikrobielle stoffer som beta laktamer og aminoglykosider, men svært effektiv mot axenically vokst Legionella, ikke i tilstrekkelig grad trenge inn i intracellulære hvor Legionella bor. ^5,6 Senere bevis antydet at teknisk mer kompliserte intracellulære vekstanalyser effektivt spådd klinisk effekt. ⁷ </sup> Dessverre er disse analysene var svært arbeidskrevende endepunkter analyser, krever infiserte makrofager, som behandles med antimikrobielle midler, som skal lyseres på ulike tidspunkter poeng for kolonidannende enhet telling. Slike analyser er upraktisk å gjøre på en stor skala, og er uegnet for høy gjennomstrømming medisiner.

Derfor har vi utviklet teknologi for sanntids måling av intracellulær bakterievekst. ^6. Dette ble oppnådd ved bruk av en bakteriestamme modifisert ved integrering av enten en bakteriell luciferase-operonet ⁸ (første generasjon assay, beskrevet tidligere) ⁴ eller fluorescerende protein ⁹ reportere (andre generasjon, ortogonal analyse, som er beskrevet her) i det bakterielle kromosom. På denne måten, luminescerende eller fluorescerende signal gir et surrogat, sanntids utlesning av bakteriell nummer.

Men disse attributtene ikke håndtere en betydelig confounder i intracellulær infection analyser, off-target effekter på vertsceller. Spesielt død vertscellen iboende begrenser intracellulær vekst og fører til falsk positiv identifikasjon av antimikrobiell effekt. Som mange forbindelser i screening biblioteker er eukaryote celle giftige, slike falske positiver vil overvelde sanne antimikrobielle midler, nødvendiggjør et stort antall oppfølging, endepunkt cytotoksisitetsassayer for oppløsning.

Dermed var det av stor interesse å kunne vurdere eukaryote celle levedyktighet og intracellulær vekst samtidig. Spesielt, et karakteristisk for ikke-levedyktige eukaryote celler er tap av cellemembranintegritet. Prober som tester permeabiliteten av cellemembranen kan derfor brukes til å vurdere cellelevedyktighet. Vi har tidligere karakterisert muligheten for en rekke putatively cellemembranen-impermeant, fluorescerende, DNA-bindende fargestoffer for å få tilgang til og beis DNA hos døde celler. ⁴ På bindende kjerne-DNA, disse fargestoffer viser en stor økning i quantum fluorescerende utbytte resulterer i økt signal over bakgrunn løsning fluorescens. Som sådan er disse fargestoffer ga en kvantitativ avlesning av eukaryotisk celledød. ⁴ Spesielt, fant vi at flere var giftfri selv ved langvarig co-inkubasjon med J774 makrofager. Da lagt ved førstegangs infeksjon, de ga en real-time, fluorescerende avlesning av eukaryote celledød som kan måles ved en mikro fluorimeter eller observert mikroskopisk.

Derfor, ved å kombinere bruk av en bakteriell reporter og ikke-giftig, membran-impermeant, DNA-bindende fargestoffer, kunne vi utvikle en enkel, ikke-destruktiv, real-time analyse for å måle både bakteriemengde og eukaryote celle cytotoksisitet samtidig. Denne analysen har tillatt oss å screene i 384-brønn plate-format ~ 10.000 kjente bioaktive stoffer, inkludert ~ 250 antimikrobielle midler og> 240.000 små molekyler med funksjonelt uncharacterized aktivitet for evnen til å hemme veksten av intracellulærLegionella pneumophila, mens på samme tid å generere eukaryote celle cytotoksisitet data for hver forbindelse. ⁶ Vår analyse av kjente antibiotika mot intracellulære vekst av Legionella var den mest omfattende utforskning av denne typen til dags dato. ⁶

Basert på effektiviteten i vår analyseformat, vi også senere utforsket de potensielt synergieffekter av kjente antibiotika når de brukes i kombinasjon. En av de mest vanlige synergi tester, den såkalte sjakkbrett-assay, blir standardmessig utføres ved å vurdere virkningene av kombinatoriske to-gangers seriefortynninger av to eller flere antimikrobielle midler. ¹⁰ I disse analysene blir synergi definert ved observasjon av større effekt når to eller flere antimikrobielle midler anvendes sammen enn summen av virkningen av hver enkelt anvendt hver for seg. Av notatet, hittil, kun fokusert og selektiv synergi testing ble utført mot intracellulære Legionella pneumophila </em> på grunn av den store krefter involvert i tradisjonelle endepunkt analyser multiplisert med kombinatoriske permutasjoner kreves.

For å lette synergi testing, har vi gjort bruk av vår sanntid intracellulær vekst / eukaryote cytotoksisitet analyse i kombinasjon med automatisert digital dispensering teknologi ^seks. Dette automatisering tillatt oss å dispensere seriefortynninger av forbindelser oppløst i DMSO eller i vandig oppløsning, alene eller i kombinasjon i 384-brønners format. ¹¹ Videre slik robust væskehåndtering teknologi tillater oss å enkelt utføre høyere oppløsning, kvadratrot-of-to (i stedet for standard, lavere oppløsning, dobling) utvannings kombinasjoner for å oppnå høyere nivåer av spesifisitet i våre to-dimensjonal, sjakkbrett synergi analyse. Denne resolusjonen var spesielt verdifull i å ta hensyn i synergi feltet om reproduserbarhet ved bruk av to-fold fortynning serien ^12. Til slutt, vår analyse var kvantitativ og også therefore målt graderinger av hemming. Som et resultat av analysen fanget helheten av hemmende informasjon, uttrykkbart i isocontour isobologrammer hvori isocontours koble kombinatoriske konsentrasjoner med tilsvarende nivåer av veksthemming. ⁶ Denne plotting strategien tillot visualisering av kombinatorisk dose-responskurver. For å illustrere vår metodikk, beskriver vi vår protokoll for å utføre disse analysene og viser representative resultater.

Protocol

1. Real Time Intracellulær Vekst og eukaryote celle Cvtotoksisitetsmålinq Forbereder vertsceller (J774A.1 celler) Kultur J774A.1 Mus musculus makrofaglignende celler i suspensjon i RPMI 1640 med 9% jern-supplementert kalveserum. Til å begynne med passasjen i vevskulturflasker. Etter at cellene er blitt konfluent i en 75 cm2 vevskulturkolbe i 15 ml medium, splittet ved skraping og fortynning til 65 ml med den samme type medium, hvorav 15 ml føres tilbake til vevskultur kolbe og…

Representative Results

Mikroplate intracellulær vekst assay Figur 1 diagrammer analysetrinn. De automatiserte trinn som er vist kan utføres manuelt. Imidlertid er gjennomstrømningen mye lettere å bruke flytende håndteringssystemer. Figur 2 viser representative resultater fra en 384-brønners mikroplate, to-avlesning, sanntids intracellulær vekst og …

Discussion

Vi beskriver sanntids analyser for simultan deteksjon av intracellulær bakteriell vekst og vertscelle cytotoksisitet. Det er flere kritiske trinn i protokollen. Først for robust analyseytelsen, må det være tilstrekkelig spektral skille mellom bakterielle og cytotoksiske avlesninger. En slik atskillelse er egenverdi for kombinasjoner av luciferase operon reportere og fluorescerende DNA-bindende fargestoffer. Men basert på vår erfaring (Tabell 1-3, Figur 2), bruk av dual krever fluo…

Materials

J774A.1 cells	American Type Culture Collection	TIB-67	Host cell
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Yeast extract, ultrafiltered	Becton-Dickinson/Difco	210929	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt	Sigma-Aldrich	K2000	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Potassium phosphate, dibasic	Thermo Fisher Scientific	P288-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C-7755	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Ammonium iron(III) citrate	Sigma-Aldrich	F5879	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately
Potassium hydroxide solution, concentrated	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Deonized water	N/A	N/A	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Thymidine (tissue culture grade)	Sigma-Aldrich	T1895	For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640
RPMI 1640, standard formulation	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 lacking phenol red	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration
Iron-supplemented calf serum	Gemini Bioproducts	100-510	For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.
GelRed, 10000X solution in water	Biotium	41003	For staining for J774A.1 cell death determination by epifluorescence microscopy (in conjunction with green fluorescent bacteria). Use Gel Red  at 1X final concentration.
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)
Orbital shaker	BellCo Glass	7744-01010	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)
Shaker flasks (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker flasks (1000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (1000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Sponge foam caps for flasks (250 ml – 1000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump	Thermo Fisher Scientific	5840300	For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes
Combi standard bore manifold	Thermo Fisher Scientific	24072670	Default predispense volume of 20 ml is insufficient to compensate for settling — increase to 80 ml
White 384 well dishes treated for tissue culture	Corning	3570	For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules)	Sigma-Aldrich	D2650	For dissolving positive control and test compounds
Azithromycin	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antibiotic positive control
Saponin (from Quillaja bark)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cytoxicity positive control
Multichannel pipettor	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette	For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing
Epson pin transfer robot	Epson/ICCB-L	(Custom equipment)	For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays
D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	D300	For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 microliters
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	For dispensing test compounds
EnVision multi-mode plate reader	Perkin-Elmer	(Contact manufacturer)	For optimal detection of SYTOX Green fluorescence, use excitation filter 485/14, emission filter 535/25, and dichroic mirror 505 nm, with selection of minimum gain and transmittance, and “high concentration mode. For luminescence detection, use the "USLUM" protocol for high-sensitivity detection. For mNeptune2 detection, use excitation filter 600/8, emission filter 665/7.5, and dichroic mirror 658 nm, with selection of gain and transmittance to achieve the highest maximum signal possible without saturating the photomultiplier.
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera	Nikon	Ti	For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution
Glass-bottom tissue culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.  These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.
Photoshop CS6	Adobe		Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.
Mathematica 10	Wolfam		For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.