Observation og Kvantificering af parringsadfærd i fyrretræsnematoden,<em> Bursaphelenchus xylophilus</em
Summary
A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.
Abstract
En metode til at observere og kvantificere parringsadfærd af fyrretræsnematoden, Bursaphelenchus xylophilus, blev etableret under et stereomikroskop. For at forbedre parring effektivitet B. Xylophilus og øge chancerne for parring observation, jomfru voksne blev dyrket og anvendt til undersøgelsen. Æg opnåedes ved at holde nematoderne i vand og lade hunnerne at lægge æg i 10 min. Andet trin yngel (J2) blev synkroniseret ved inkubering af æg til 24 timer ved 25 ° C i mørke, og tidlig J4 blev opnået ved dyrkning af J2 med gråskimmel, Botrytis cinerea, for en anden 52 timer. På dette tidspunkt, kunne de fleste J4 nematoder være klart adskilt som mand eller kvinde ved hjælp af deres kønsorganer morfologi. Den mandlige og kvindelige J4 blev opsamlet og dyrket separat i to forskellige petriskåle i 24 timer for at få jomfruelige voksne nematoder. En jomfru mandlige og en jomfru kvinde blev parret i en dråbe watis i brønden af en konkav objektglas. Den parring opførsel blev filmet med en video-optager under et stereomikroskop. Hele periode af parring proces var 82,8 ± 3,91 min (gennemsnit ± SE) og kunne opdeles i 4 forskellige faser: søgning, kontakt, kopulerende og dvælende. De gennemsnitlige minutter af varighed var 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 og 7,2 ± 0,5, hhv. Elleve sub-adfærd blev beskrevet: cruising, nærmer sig, støder, røre, hooping, lokalisering, fastgørelse, sædafgang, adskillelse, ubevægelighed, og roaming. Interessant nok blev observeret indlysende intra-seksuel konkurrence, når en kvindelig blev grupperet med 3 hanner eller en han med 3 hunner. Denne protokol er nyttig og værdifuld, ikke kun i at undersøge parring adfærd B. xylophilus, men også i at fungere som en reference for etologiske studier af andre nematoder.
Introduction
The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle, is one of the most destructive invasive species, causing the wilting and eventual death of pine trees. This pathogenic nematode is believed to be native to the USA, but it was transported to several countries, including China, Japan, South Korea, and Portugal. Recently, it has also been reported in Spain, killing millions of pine trees at huge economic losses and threatening forest production and ecological stability1-5.
Once a host pine tree is infected by pinewood nematodes, thousands of millions of offspring are propagated rapidly within the trunk. This causes xylem dysfunction, resulting in wilting and eventually in the death of the host tree6. However, there is currently no efficient way to control this disease. Mating behavior might play an important role in the high fecundity of this nematode7. We therefore investigated the mating behavior of B. xylophilus in the laboratory, trying to find an effective way of disturbing its mating and decreasing its fecundity.
This protocol is intended to introduce the detailed methods of how to obtain the virgin adults of B. xylophilus and how to observe and analyze the mating behavior using a video recorder and a stereomicroscope. This protocol can also be used as a reference for behavioral studies of other nematodes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adfærdsmæssige tests er et grundlæggende aspekt af kemisk økologi, neurobiologi, molekylærbiologi og genetik. Nematoder og især C. elegans, er flittigt brugt til undersøgelser på disse områder. Parringsadfærden af C. elegans er tidligere 10-11 blevet undersøgt. Men B. xylophilus er gonochoristic og forskellig fra de hermafroditiske C. elegans, og dens dertil passende proces har forskellige adfærdsmæssige funktioner 9. For nylig blev parringsadfærd a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najie Zhu og Liqun Bai bidrog ligeligt til dette arbejde. Dette arbejde blev støttet af den særlige fond for skovbrug Videnskabelige Undersøgelser i den offentlige velfærd (201204501) og National Natural Science Foundation of China (31170604, 31270688, og 31.570.638). Vi takker Dr. Holighaus Gerrit og Dr. Danielle Hickford for deres nyttige forslag på engelsk skriftligt.
Materials
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121°C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
- Tokushige, Y., Kiyohara, T. Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees. J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).
- Sun, Y. C. Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen’s mausoleum in Nanjing. J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47 (1982).
- Mota, M. M., et al. First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe. Nematology. 1, 727-734 (1999).
- Robertson, L., et al. Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain. Nematology. 13, 755-757 (2011).
- Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. Pine wilt disease: a threat to European forestry. Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).
- Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions. Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).
- Mamiya, Y., Furukawa, M. Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus. Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).
- Mamiya, Y., Kiyohara, T. Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees. Nematologica. 18, 120-124 (1972).
- Liu, B. J., et al. Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process. Nematology. 16, 895-902 (2014).
- Simon, J. M., Sternberg, P. W. Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).
- Barr, M. M., Garcia, L. R. Male mating behaviour. The C. elegans Research Community Wormbook. , (2006).
- Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus. J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).
