Observasjon og Kvantifisering av Mating Behavior i Pinewood nematode,<em> Bursaphelenchus xylophilus</em
Summary
A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.
Abstract
En metode for å observere og kvantifisere parring oppførselen til furu nematode, Bursaphelenchus xylophilus, ble etablert under et stereomikroskop. For å forbedre parring effektivisere B. xylophilus og for å øke sjansene for parring observasjon, jomfruelige voksne ble dyrket og brukt til etterforskningen. Egg ble oppnådd ved å holde nematoder i vann og la hunnene å legge egg i 10 min. I det annet trinn unger (J2) ble synkronisert ved inkubering av eggene i 24 timer ved 25 ° C i mørke, og den tidlige J4 ble erholdt ved dyrking av den J2 med grå mugg, Botrytis cinerea, for en annen 52 timer. På dette tidspunktet, kan de fleste J4 nematoder være tydelig atskilt som å være mann eller kvinne ved hjelp av sine genital morfologi. Den mannlige og kvinnelige J4 ble samlet og dyrket separat i to forskjellige petriskåler i 24 timer for å få jomfruelige voksne nematoder. En jomfru mannlig og en jomfru kvinnelig var forbundet i en dråpe water i brønnen av en konkav lysbilde. Parings atferd ble filmet med en videoopptaker under et stereomikroskop. Hele perioden av paringsprosessen var 82,8 ± 3,91 min (gjennomsnitt ± SE) og kan deles inn i 4 forskjellige faser: søking, kontakter, copulating, og dvelende. De midlere minuttene av varighet var 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 og 7,2 ± 0,5, respektivt. Elleve under atferd ble beskrevet: cruising, nærmer seg, møter, rørende, hooping, lokalisering, feste, ejaculating, separering, quiescence, og roaming. Interessant nok ble observert åpenbart intra-seksuell konkurranse når en kvinne ble gruppert med 3 menn eller en mann med 3 tisper. Denne protokollen er nyttig og verdifull, ikke bare i å undersøke parring oppførselen til B. xylophilus, men også i å opptre som en referanse for etologiske studier av andre nematoder.
Introduction
The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle, is one of the most destructive invasive species, causing the wilting and eventual death of pine trees. This pathogenic nematode is believed to be native to the USA, but it was transported to several countries, including China, Japan, South Korea, and Portugal. Recently, it has also been reported in Spain, killing millions of pine trees at huge economic losses and threatening forest production and ecological stability1-5.
Once a host pine tree is infected by pinewood nematodes, thousands of millions of offspring are propagated rapidly within the trunk. This causes xylem dysfunction, resulting in wilting and eventually in the death of the host tree6. However, there is currently no efficient way to control this disease. Mating behavior might play an important role in the high fecundity of this nematode7. We therefore investigated the mating behavior of B. xylophilus in the laboratory, trying to find an effective way of disturbing its mating and decreasing its fecundity.
This protocol is intended to introduce the detailed methods of how to obtain the virgin adults of B. xylophilus and how to observe and analyze the mating behavior using a video recorder and a stereomicroscope. This protocol can also be used as a reference for behavioral studies of other nematodes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Atferdstester er en grunnleggende del av kjemisk økologi, nevrobiologi, molekylærbiologi og genetikk. Nematoder, og spesielt C. elegans, er mye brukt for studier i disse områdene. Den parring oppførselen til C. elegans har tidligere blitt 10-11 undersøkt. Men B. xylophilus gonochoristic og forskjellig fra de tvekjønnet C. elegans og sin paring prosessen har forskjellige atferds funksjoner 9. Nylig ble det parring oppførselen til Bursaphelenchus okinawa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najie Zhu og Liqun Bai bidratt likt til dette arbeidet. Dette arbeidet ble finansielt støttet av Special Fund for skogbruk Scientific Research i Public Welfare (201204501) og Natural Science Foundation National of China (31170604, 31270688, og 31570638). Vi takker Dr. Holighaus Gerrit og Dr. Danielle Hickford for sine nyttige forslag om engelsk skriftlig.
Materials
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121°C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
- Tokushige, Y., Kiyohara, T. Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees. J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).
- Sun, Y. C. Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen’s mausoleum in Nanjing. J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47 (1982).
- Mota, M. M., et al. First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe. Nematology. 1, 727-734 (1999).
- Robertson, L., et al. Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain. Nematology. 13, 755-757 (2011).
- Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. Pine wilt disease: a threat to European forestry. Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).
- Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions. Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).
- Mamiya, Y., Furukawa, M. Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus. Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).
- Mamiya, Y., Kiyohara, T. Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees. Nematologica. 18, 120-124 (1972).
- Liu, B. J., et al. Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process. Nematology. 16, 895-902 (2014).
- Simon, J. M., Sternberg, P. W. Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).
- Barr, M. M., Garcia, L. R. Male mating behaviour. The C. elegans Research Community Wormbook. , (2006).
- Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus. J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).
