자가 혈청 인간 중간 엽 기질 세포 (중배엽 줄기 세포)를 배양, 이종 재료 및 기타 부정적인 영향에 의한 거부 반응의 위험을 줄일 수 있습니다. 또한 신선한 중배엽 줄기 세포를 제공 할 수 중배엽 전구 세포의 부분 집합의 복구 할 수 있습니다. 자가 섬유소 응고에 중배엽 줄기 세포를 포함하면 취급이 용이하고 효과적인 수술 주입을 할 수 있습니다.
인간 중간 엽 기질 세포 (중배엽 줄기 세포는) 다른 미디어와 체외에서 배양한다. 임상에서의 사용에 대한 제한은, 그러나, 주로 그들의 문화에 대한 이종 영양소에 의해 가해지는 잠재적 생물과 염증 위험에 따라 달라집니다. 인간 유도체 또는 재조합 물질이 반응을 줄이기 위해 먼저 선택 후보이다. 따라서, 문화 보충 및자가 원산지 재료는 최고의 영양과 안전한 제품을 나타냅니다.
여기, 우리는자가 조건의 분리 및 골수 중배엽 줄기 세포의 배양을위한 새로운 프로토콜을 설명하는 – 즉, 환자 유래 혈청을 hMSC 관리를위한 발판으로 문화 매체와 섬유소를위한 보충 교재로. 사실, hMSC / 섬유소 응고 구조는 여러 임상 적용에 매우 유용 할 수있다. 특히, 우리는 기증자의 자신의 혈액에서 파생 된 섬유소 응고 허용 정형 외과에서의 사용에 초점효과적인 세포 전달 및 영양 / 폐기물 교환. 최적의 안전 조건을 보장하기 위해, hMSC 변태 조직 과증식의 위험을 방지하기 위해 매우 중요하다. 이러한 이유로,이 문서에서 설명하는 방식은 이에 후속 제어되지 않은 위험을 감소, 주입 전에 세포 노화 및 형태 학적 변화 및 단기 골관절염 분화를 감소시키는 골 형성 혈통 사양을 유도하는 최소한의 생체 hMSC 확장을 나타낸다 분아 증식.
중배엽 간질 세포 (중배엽 줄기 세포)가 골 형성을 촉진 1,2- 조직 공학에서의 사용을위한 최적의 셀 소스 중 하나를 나타낸다. 그들은 쉽게 골수 및 기타 성인 조직에서 분리, 및 CD90, CD105, CD73 한 전형적인 표면 마커를 표현하고 있습니다. 또한, 이들은 예 골아, 연골 세포 및 지방 세포 (3)와 같은 여러 종류의 세포로 분화 할 수있다. 이들의 치료 효과들은 재생과 영양 특성 (4)에 기인한다. 중배엽 줄기 세포는 다른 회생 임상 응용 프로그램에서뿐만 아니라, 정형 외과 수술에 사용할 수 있습니다. 이들은 바람직하게는 임상 적 결과 (5)을 개선하기 위해, 발판과 결합된다.
다른 재료에 비해, 피브린 겔은 접착 성, 재 흡수 및 조직 공학 응용 -6,7- 다양한 것이 매우 유용한 영양소의 효율적인 전송 흥미로운 특성을 나타낸다.
<p c아가씨 = "jove_content"> 완전 생체 적합성 및 biosafe 비계 및 감염성 또는 반응성 효과를 피하는 이종없는 배지를 획득한다 임상 응용 프로그램에 조직 공학적 접근 방법을 번역의 주요 과제.우리 환자 자신의 혈액으로부터 유래있어서, 피브린 겔, 및자가 혈청, 체외 중배엽 줄기 세포 배양, 정형 외과 분야 8 가능한 치료 용액으로 사용 하였다.
임상 목적을 위해, 중배엽 줄기 세포는 일반적으로 두 가지 절차를 통해 투여된다 : (ⅰ) 중 전부 또는 (즉, 단핵 세포) 농축 골수의 자동 이식을 허용하는 "한 단계"절차 (즉, 최소한의 조작),, 수술 중; 및 (ii) 주입 전에 수율을 증가시키는 중배엽 줄기 세포의 생체 외 팽창을 기반으로하는 "은 두 단계의"절차 (즉, 광범위한 조작), 및 G를 필요MP 시설 (9). 신선한에 체외 분화 할 수있는, – (단핵 문화 10 % 1)라고 중배엽 전구 세포 (MPC와) 흥미롭게도, 대신 소 혈청의 인간 성인의 혈청 배양 세포는 세포의 부분 집합의 함께 중배엽 줄기 세포로 복구 할 수 있습니다 중배엽 줄기 세포 10, 11. 따라서 hMPCs는 중배엽 줄기 세포 형 (12, 13)와 비교할 때 회생 과정에서 중요한 역할을 할 수있다. 마지막으로, 단기 골관절염 유도 잠재적 자신의 증식을 잃고 12 생존 않고 골 형성 혈통으로 분화를 시작하는 중배엽 줄기 세포를 푸시합니다. 이러한 결과는 골 형성 매체 (14)의 예비 배양 한 다음 중배엽 줄기 세포로 생체 내 골 형성에 향상된보고 한 이전의 연구를 확인합니다. 또한, 세포 전달을위한 지지체로서자가 혈장 응고 쉽게 의사에 의해 조작 뼈 공동 (13)의 형상에 맞춰 성형 될 수있다.
일erefore,이 방법은 정형 외과 분야에서 침대 옆에 벤치에서 자신 hMSC 기반 치료를 번역을 목표로하는 연구자와 임상의를위한 매우 유용 할 수 있습니다.
이 프로토콜의 우려가있는 중요한 단계 biosafe hMSC 치료를 얻을 수 있도록 인간 성인 혈청 프로테아제의 용도. 단백질 분해 효소가 된 MPC의, 수확을 보장하면서 특히, 인간 성인의 혈청, 격리 및 유지 보수를 할 수 있습니다. 다음은 이와 같이 배양 시간에 따라 생존 중배엽 줄기 세포의 저장을 보장 신선한 중배엽 줄기 세포를 야기 할 수있는 골수에 존재 미숙 세포이다. 프로테아제 활성에 대한 노출 시간을 증가 시키면 hMSC 생존에 불리하기 때문에하지 모든 된 MPC가 수집 될 수있다. 이러한 이유로, 10 분간 프로테아제 인큐베이션 된 MPC의 회수 및 중배엽 줄기 세포의 생존 사이의 최적의 절충으로서 선택 하였다. 또 다른 중요한 단계는 osteodifferentiation 시간입니다. 실제로, 생체 osteodifferentiation의 광범위한 상당히 따라서 생체 내에서 최종 골 형성에 영향을 미치는 세포 생존을 감소시킬 것이다. 마지막으로 중요한 단계가자가 생 흡수성 지지체의 쓸모가에있다, whicH 혈장 응고에서 피브린 겔에서 세포 (중배엽 줄기 세포 및 된 MPC)를 매립함으로써 얻어진다.
MPC와 수율을 향상시키기 위해 필요한 주요 단계는 높은 농도에서 단핵 세포를 시드한다. 혈장을 얻기 위해 성분 채집 절차를 사용하여, 칼슘 글루코 네이트로 처리하는 것이 가능 다량자가 혈청을 달성 할 수있다. 중간 보충 인간 혈청 hMSC 배양 태아 소 혈청 (FBS)에 필적하는 것으로 관찰되었다. 그러나, 우리의 경험에서, FBS와 보충 전체 매체는 인간의 성인 혈청보다 더 빨리 노화에 기여한다. 중요한 단계는 중배엽 줄기 세포에 대한 최소한의 osteoinduction 관리이다. 사실,이 치료는 따라서 생체 내에서 추가로 세포 변형을 방지하는 데 유용되고, 쉽게 골 형성 혈통으로 차별화하는 세포를 이끈다. 최소 osteoinduced 중배엽 줄기 세포의 좋은 생존을 유지하기 위해서는 신중하게 단계 6.5에 설명 된 권장 사항을 준수하는 것이 좋습니다.D 8.2., 처리, 원심 분리 및 중간 금액을 포함하는 추가합니다. 성분 채집 방법을 사용할 수없는 경우, 풀링 된 AB 혈청을 구입하여, 다른 방법으로, 환자에게 무 또는 여러 혈액을 수행하여 프로토콜을 수행하는 것이 여전히 가능하다. 물론, 벤치 투 맡에서이 프로토콜을 가지고 위해서는 가능한 GMP 세포 공장 또는 등가물을 갖도록 강제된다.
골수염의 영향이 기술에 관심 빈혈, 혈액 – 종양 및 정형 외과 환자의 적용에 한계., 빈혈 환자에서 혈액의 많은 양의 그림은 피해야한다. 골수염 환자의 감염의 최종 결과에 영향을 미칠 수있는 반면, 환자의 종양 학적, 세포 샘플의 품질, 화학 요법 치료제에 의해 영향을 받는다. 자가 혈청 부족하거나 부적합 인 모든 경우에서, 풀링 남성 AB 혈청 좋은 대안을 나타낸다.
셀 / 섬유소 클리오 사용가능한 임상 응용 프로그램에 대한 t 구조는 뼈가 아닌 노동 조합 (13)을 치료하기 위해 우수한 성과의 결과로, 수술 중 처리 및 금형 쉽게 될 수있는 완전히자가 세포 치료를 발표 할 중요합니다. 최소한의 조작 및 광범위한 조작 9 : 임상 목적을 위해, 중배엽 줄기 세포는 일반적으로 두 가지 절차를 통해 관리됩니다. 이러한 세포 형태와 크기가 18 이상으로서 광범위한 생체 외 배양과 관련된 문제를 극복하기 위해, 우리는 생체 세포의 확장 및 분화 골관절염 (단지 4 d) 단시간을 수행 하였다.
보여 짧은 셀 확장 및 osteodifferentiation 시간과 함께,이 문서에서 설명하는 이종없는 프로토콜, 조직과 성장과 변화의 증거없이, 생체 내에서 빠른 골 생성을 얻기 위해 병원에 관련하는, 따라서 확인의 효과와 긴 뼈 수리 -term 안전 (그림 5) </stroNG> 13.
이 보고서에 제시된 방법론은 정형 외과에서 가능한 사용을위한자가 조건 체외 확장에 hMSC의 효능과 안전성을 입증 대상으로합니다. 이 프로토콜은 매체자가 혈청 따라서 완전히자가 세포 치료를 보장하는자가 피브린 응고에 포함 된 골수로부터 분리 배양 중배엽 줄기 세포를 사용한다. 두 배의 골 형성 유도, 그냥 두 번째 분리하기 전에, 조골 세포로 분화 할 수 hMSC 능력을 향상시킵니다. 이 불유합에 한정되지 않기 때문에, 결과적으로,이 기술은, 골 결손 애플리케이션에 특히 적합하다. 가능한 미래 응용 프로그램은 거골 낭종과 뼈 손실 관리를 포함 할 수있다.
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by the Tuscany Region (grant number 539999_2014_Petrini_CUCCS). The authors would like to thank Prof. S. Berrettini for authorizing the use of the Otolab laboratory and instruments, and the surgery staff from the Orthopedic Clinic II of the University of Pisa, for the fundamental cooperation in sample harvesting. The support provided by Dr. F. Scatena is gratefully acknowledged. Finally, many thanks are due to Mr. J.G. De La Ossa for his precious contribution to histologic processing.
Triple Select (1x) | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 12563-029 | cell culture |
Trypan blue stain | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
DMEM-LG, no glut, no phenol red | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 11880-028 | cell culture |
Glutamax (100X) | Gibco, Life Technologies | 35050038 | cell culture |
Penicillin Streptomycin sol. | Gibco, Life Technologies | 15140122 | cell culture |
Alamar Blue (AB) | Gibco, Life Technologies | DAL1025 | proliferation/viability assay |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-14440-02 | cell culture |
D-PBS | Gibco, Life Technologies | 14190-094 | cell culture |
StemMACS AdipoDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-677 | cell culture |
StemMACS ChondroDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-679 | cell culture |
hMSC Osteogenicdiff BulletKit | Euroclone | LOPT3002 | cell culture |
Vitamin C (ascorbic acid) | Bayer | ATC Code: A11GA01 | Pharmaceutical grade drug |
Flebocortid Richter (hydrocortisone) | Aventis Pharma | ATC Code: H02AB09 | Pharmaceutical grade drug |
Victor X3, reader | PerkinElmer | 2030 multilabel reader | proliferation/viability assay |
Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | histological assay |
Pyrogallol | Sigma Aldrich | 16040 | histological assay |
Sodium Thiosulphate | Sigma Aldrich | S8503 | histological assay |
Histoplast LP | Thermo Scientific | 8332 | histological assay |
Methanol | Sigma Aldrich | 32213 | histological assay |
Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | histological assay |
Nuclear fast red | Sigma Aldrich | 60700 | histological assay |
Formalin | Bio-optica | 05-K01009-X40 | histological assay |
Eosin B | Sigma Aldrich | 45260 | histological assay |
DPX | Sigma Aldrich | 6522 | histological assay |
Haematoxylin | Sigma Aldrich | H3136 | histological assay |
Aluminium Sulphate | Sigma Aldrich | 202614 | histological assay |
Xylol | Sigma Aldrich | 534056 | histological assay |
Microtome | Leika | histological assay | |
May Grunwald | Sigma Aldrich | MG1L-1L | histological assay |
Giemsa | Sigma Aldrich | 32884-250ML | histological assay |
Transfer bag | Biomérieux | BC0300031 | cell culture |
Filtration kit | Macopharma | BC0800010 | cell culture |
Calcium Gluconate | Galenica Senese | Pharmaceutical grade drug | |
Bact Alert | Biomérieux | 259790 anaerobic | microbiological assay |
Bact Alert | Biomérieux | 259789 aerobic | microbiological assay |
Steryle Luer-Lok Syringe 50 ml | BD Plastipak | 300865 | cell processing |
Heraeus Cryofuge 6000i | Thermo Scientific | blood bag centrifuging | |
SL16R Centrifuge | Thermo Scientific | blood tube centrifuging |