Dyrking menneskelige Mesenchymale stromale celler (hMSCs) med autolog serum, reduserer risikoen for avvisning av xenogene materiale og andre negative effekter. Den gjør det også for utvinning av en undergruppe av mesodermal stamfedre, som kan levere ferske hMSCs. Embedding hMSCs i et autologt fibrinaggregat gjør håndteringen enkel og effektiv kirurgisk implantasjon.
Menneskelige Mesenchymale stromaceller (hMSCs) dyrket in vitro med forskjellige medier. Begrensninger på deres bruk i kliniske settinger, men først og fremst avhenge av potensielle biohazard og betennelser risikoer som utøves av xenogene næringsstoffer for deres kultur. Menneske derivater eller rekombinante materiale er førstevalget kandidater til å redusere disse reaksjonene. Derfor kulturtilskudd og materialer av autolog opprinnelse representerer de beste næringsstoffer og de sikreste produktene.
Her beskriver vi en ny protokoll for isolering og kultur av benmargs hMSCs i autologe forhold – nemlig pasient-avledet serum som et supplement til kulturmedium og fibrin som et stillas for HMSC administrasjon. Faktisk kan HMSC / fibrinaggregat konstruksjoner være svært nyttig for flere kliniske applikasjoner. Spesielt fokuserer vi på deres bruk i ortopedisk kirurgi, hvor fibrinkoagelen avledet fra giverens eget blod tillatteffektiv celle levering og næringsstoffer / avfallsbørser. For å sikre optimale sikkerhetsforhold, er det av største betydning for å unngå risikoen for HMSC transformasjon og vev gjengroing. Av disse grunner, er metoden som er beskrevet i denne artikkelen indikerer også en minimal ex vivo HMSC ekspansjon, for å redusere celle-senescens og morfologiske forandringer, og kortvarig osteo-differensiering før implantering, for å indusere osteogene avstamning spesifikasjon, og dermed redusere risikoen for etterfølgende ukontrollert spredning.
Menneskelig Mesenchymale stromale celler (hMSCs) representerer en av de beste cellekilder for bruk i tissue engineering for å fremme osteogenesis 1,2. De er lett isolert fra benmarg og andre voksne vev, og uttrykker typiske overflatemarkører som CD90, CD105, CD73 1. Videre kan de differensiere til flere celletyper, så som osteoblaster, kondrocytter og adipocytter 3. Deres terapeutiske effekter er knyttet til deres regenererende og trofiske egenskaper 4. hMSCs kunne brukes i ortopedisk kirurgi, så vel som i andre regenerativ kliniske anvendelser. De blir fortrinnsvis kombinert med stillasene, for å forbedre den kliniske resultatet 5.
Sammenlignet med andre materialer, viser fibrin-gelen interessante egenskaper slik som klebrighet, resorpsjon og effektiv transport av næringsmidler, som gjør det svært nyttig for en rekke forskjellige vev tekniske anvendelser 6,7.
<p class = "jove_content"> Hovedutfordringen i sette en tissue engineering tilnærming til kliniske anvendelser er å skaffe et fullt biokompatibel og BIOSAFE stillas og et xeno fritt kulturmedium som unngår enhver infeksiøs eller reaktiv effekt.I vår fremgangsmåte, fibringel, avledet fra pasientens eget blod, og autologt serum, for in vitro hMSCs kultur, ble anvendt som en mulig terapeutisk løsning på den ortopediske felt 8.
For kliniske formål, er hMSCs vanligvis administreres via to hovedtiltak: (i) "one-step" prosedyren (dvs. minimal manipulasjon), som gjør at bilen transplantasjon av benmarg, enten hele eller konsentrert (dvs. mononukleære celler), under operasjonen; og (ii) "to-trinns" fremgangsmåten (dvs. omfattende manipulasjon), som er basert på ex vivo ekspansjon av hMSCs for å øke utbyttet før implantering, og krever GMP fasiliteter 9. Interessant, dyrking av cellene med et voksent menneske serum i stedet for bovint kalveserum tillater utvinning, sammen med hMSCs, av en undergruppe av celler (1 – 10% i mononukleære kulturer) kalt mesodermal progenitorceller (MPCS), i stand til in vitro differensiering i frisk hMSCs 10,11. Således kan hMPCs spille en betydelig rolle i den regenerative prosessen sammenlignet med hMSCs alene 12,13. Til slutt presser kortsiktig osteo-induksjon hMSCs å starte sin differensiering inn i osteogene avstamning uten å miste sin proliferativ potensial og levedyktighet 12. Disse resultater bekrefter de tidligere studier som har rapportert forsterket in vivo bendannelse ved hMSCs, etterfulgt av en forkultur i osteogene medium 14. Videre kan et autologt plasma blodpropp som et stillas for celle levering lett manipuleres av kirurgen og formet til å passe formen av benhulrommet 13.
therefore, kan denne metoden være svært nyttig for de forskere og klinikere som tar sikte på å oversette deres HMSC basert terapi fra benk til sengen i ortopedisk applikasjoner.
De kritiske trinn av denne protokoll har med bruk av et voksent menneske serum og protease, noe som tillater å oppnå en BIOSAFE HMSC terapi. Spesielt gjør at menneske voksen serum isolasjon og vedlikehold, mens protease sikrer avling, av MPCS. Disse er umodne celler i benmargen som kan gi opphav til nye hMSCs, og dermed sikre et reservoar av levedyktige hMSCs langs kulturen tid. Ikke alle MPCS kan samles, ettersom øke eksponeringstiden til den protease-aktivitet er skadelig for HMSC levedyktighet. Av denne grunn ble en 10 min inkubasjon protease valgt til optimalt kompromiss mellom utvinning av MPCS og levedyktigheten til hMSCs. Et annet kritisk punkt er osteodifferentiation tid. Faktisk ville en utstrakt in vitro osteodifferentiation betraktelig redusere cellenes levedyktighet, og dermed påvirke slutt bendannelse in vivo. Den siste kritiske trinnet består i availing av en autolog bioresorberbart stillaset, hh oppnås ved å bygge cellene (hMSCs og MPCS) i en fibrin gel fra plasma clotting.
Et viktig skritt for å forbedre utbyttet av MPCS er i frø mononukleære celler ved høyere konsentrasjon. Ved hjelp av aferese for å oppnå plasma og behandle det med kalsiumglukonat gjør det mulig å oppnå autologt serum i store mengder. Det har blitt observert at humant serum som et medium supplement er sammenlignbare med føtalt bovint serum (FBS) i HMSC kulturer. Men i vår erfaring, en komplett medium supplert med FBS bidrar til raskere alderdom enn voksent menneske serum. Et viktig skritt er at tilførsel av en minimal osteoinduction til hMSCs. Faktisk, dette fører behandling cellene for enkelt å skille mot osteogene avstamning, og dermed være nyttig for å unngå ytterligere celle transformasjon in vivo. For å opprettholde en god levedyktigheten til minimal osteoinduced hMSCs, anbefales det å følge nøye anbefalingene beskrevet i trinn 6.5. end 8.2., inkludert håndtering, sentrifugering og mellom beløp som skal legges til. Hvis en aferese prosedyre ikke er tilgjengelig, er det fortsatt mulig å gjennomføre denne protokollen ved å utføre flere blod trekker til pasienten, eller i alternativ, ved å kjøpe samlet AB sera. Selvfølgelig, for å bringe denne protokollen fra benken til sengen, er det obligatorisk å ha GMP cellefabrikker eller ekvivalenter, tilgjengelig.
Begrensninger i anvendelsen av denne teknikken bekymring blodfattig, hematologiske-onkologi og ortopediske pasienter rammet av osteomyelitt., Tegning store mengder blod fra anemiske pasienter, bør unngås. I onkologiske pasienter, er kvaliteten på celleprøver påvirket av kjemoterapi behandlinger, mens i osteomyelitt pasienter infeksjonen kan påvirke det endelige resultatet. I alle tilfeller der autolog serum er utilstrekkelig eller uegnet, samlet mannlig AB sera representere et godt alternativ.
Ved hjelp av celle / fibrin cloT-konstruksjoner for mulige kliniske applikasjoner er avgjørende for å slippe en helt autolog celleterapi, som kan være lett å håndtere og mugg under operasjonen, noe som resulterer i gode resultater for å behandle bein ikke-fagforeninger 13. For kliniske formål, blir hMSCs vanligvis administreres via to hovedtiltak: minimal manipulasjon og omfattende manipulering 9. For å overvinne problemene knyttet til en omfattende ex vivo kultur, som for eksempel avvik i cellemorfologi og størrelse 18, utførte vi en kort tid ex vivo celleutvidelse og osteo-differensiering (bare 4 d).
The Xeno-free-protokollen er beskrevet i denne artikkelen, sammen med de korte celle ekspansjon og osteodifferentiation ganger vist seg å være relevant i klinikker for å få rask bein produksjon in vivo, uten tegn på vev gjengroing og transformasjon, og dermed bekrefter sin effekt og lang -term sikkerhet i bein reparasjon (figur 5) </strong> 13.
Metodikken presenteres i denne rapporten er rettet mot å demonstrere effekt og sikkerhet av HMSC in vitro ekspansjon i autologe vilkår for mulig bruk i ortopedisk kirurgi. Denne protokollen benytter hMSCs isolert fra benmarg og dyrket i et medium supplert med autologt serum og innleiret i autologe fibrinkoagel, og dermed sikre en fullstendig autolog celle terapi. De to-fold osteogene induksjon, like før den andre løsgjøring, forbedrer HMSC evne til å differensiere til osteoblaster. Som et resultat, er denne teknikken spesielt egnet for anvendelser i bendefekter, siden den ikke er begrenset til pseudartrose. Mulige fremtidige søknader kan innebære Talos cyste og bentap ledelse.
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by the Tuscany Region (grant number 539999_2014_Petrini_CUCCS). The authors would like to thank Prof. S. Berrettini for authorizing the use of the Otolab laboratory and instruments, and the surgery staff from the Orthopedic Clinic II of the University of Pisa, for the fundamental cooperation in sample harvesting. The support provided by Dr. F. Scatena is gratefully acknowledged. Finally, many thanks are due to Mr. J.G. De La Ossa for his precious contribution to histologic processing.
Triple Select (1x) | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 12563-029 | cell culture |
Trypan blue stain | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
DMEM-LG, no glut, no phenol red | GIBCO, LIFE TECHNOLOGIES | 11880-028 | cell culture |
Glutamax (100X) | Gibco, Life Technologies | 35050038 | cell culture |
Penicillin Streptomycin sol. | Gibco, Life Technologies | 15140122 | cell culture |
Alamar Blue (AB) | Gibco, Life Technologies | DAL1025 | proliferation/viability assay |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-14440-02 | cell culture |
D-PBS | Gibco, Life Technologies | 14190-094 | cell culture |
StemMACS AdipoDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-677 | cell culture |
StemMACS ChondroDiff Media | Miltenyi Biotech | 130-091-679 | cell culture |
hMSC Osteogenicdiff BulletKit | Euroclone | LOPT3002 | cell culture |
Vitamin C (ascorbic acid) | Bayer | ATC Code: A11GA01 | Pharmaceutical grade drug |
Flebocortid Richter (hydrocortisone) | Aventis Pharma | ATC Code: H02AB09 | Pharmaceutical grade drug |
Victor X3, reader | PerkinElmer | 2030 multilabel reader | proliferation/viability assay |
Silver nitrate | Sigma Aldrich | 209139 | histological assay |
Pyrogallol | Sigma Aldrich | 16040 | histological assay |
Sodium Thiosulphate | Sigma Aldrich | S8503 | histological assay |
Histoplast LP | Thermo Scientific | 8332 | histological assay |
Methanol | Sigma Aldrich | 32213 | histological assay |
Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | histological assay |
Nuclear fast red | Sigma Aldrich | 60700 | histological assay |
Formalin | Bio-optica | 05-K01009-X40 | histological assay |
Eosin B | Sigma Aldrich | 45260 | histological assay |
DPX | Sigma Aldrich | 6522 | histological assay |
Haematoxylin | Sigma Aldrich | H3136 | histological assay |
Aluminium Sulphate | Sigma Aldrich | 202614 | histological assay |
Xylol | Sigma Aldrich | 534056 | histological assay |
Microtome | Leika | histological assay | |
May Grunwald | Sigma Aldrich | MG1L-1L | histological assay |
Giemsa | Sigma Aldrich | 32884-250ML | histological assay |
Transfer bag | Biomérieux | BC0300031 | cell culture |
Filtration kit | Macopharma | BC0800010 | cell culture |
Calcium Gluconate | Galenica Senese | Pharmaceutical grade drug | |
Bact Alert | Biomérieux | 259790 anaerobic | microbiological assay |
Bact Alert | Biomérieux | 259789 aerobic | microbiological assay |
Steryle Luer-Lok Syringe 50 ml | BD Plastipak | 300865 | cell processing |
Heraeus Cryofuge 6000i | Thermo Scientific | blood bag centrifuging | |
SL16R Centrifuge | Thermo Scientific | blood tube centrifuging |