Kirurgiska förfaranden och metodik för en preklinisk murinmodell av<em> De Novo</em> Mammakreftmetastas

Summary

Prekliniska modeller som utvärderar adjuverande terapi riktade mot metastasering av bröstcancer saknas. För att ta itu med detta utvecklade vi en murin modell av de novo pulmonell adenokarcinommetastas i lungmammar, varvid terapier administrerade i adjuvansinställningen (postoperativ resektion av primära tumörer) kan utvärderas för effektivitet vid påverkan av tidigare utsöndrade pulmonella metastaser.

Abstract

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women¹. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Introduction

Kvinnor i Nordamerika har en livslängd på 12% för att utveckla bröstcancer ² ; En majoritet av dessa individer kommer att ha primära tumörer avlägsnas via kirurgi, och beroende på cancer subtyp, kommer då att få riktade, endokrina, kemo- och / eller strålningsterapi i adjuvansinställningen ³ . Exempel är att kvinnor diagnostiserats med hormonreceptor-positiva cancerformer som mottar antiöstrogenterapier och kvinnor med HER2-positiva tumörer som tar emot HER2-riktade terapier med strålning / kemoterapi, medan inga riktade terapier finns tillgängliga för triple negativa tumörer ³ . Trots framsteg inom strålning, kemoterapi, personliga och hormonbaserade terapier som kompletterar kirurgisk resektion uppstår sjukdom hos 30-70% av kvinnor diagnostiserade med stadium II eller III-sjukdom ⁴ , eftersom behandlingar i stor utsträckning är ineffektiva vid utrotning av metastatisk sjukdom i avlägsna organ, däribland Lunga, ben, bRegn och / eller lever ⁵ . Detta är särskilt signifikant med tanke på att när metastatisk sjukdom uppstår i frånvaro av primär tumöråterväxt, innebär detta att spridda maligna celler troligen redan var närvarande i sekundära organ vid tidpunkten för den definitiva operationen. Således är behandlingar som kan utrota eller långsam tillväxt av metastatiska tumörer brådskande nödvändiga.

Medan de novo- musmodellerna av mammakarcinogenes har varit anmärkningsvärt informativa i avslöjande mekanismer som reglerar neoplastisk progression ¹ , har befintliga modeller också flera begränsningar. En av dessa är det faktum att de novo transgena modellerna typiskt utvecklar primära tumörer i flera bröstkörtlar, där primär tumörbörda begränsar studiens varaktighet. Medan primär tumörcellsflöde och metastatisk utsöndring sannolikt inträffar tidigt i neoplastisk progression i dessa modeller, uppträder frank utveckling av metastatiska tumörer sent och beroende oN musmodellen och belastningsbakgrunden, är ofta delvis penetrerande ¹ . Detta begränsar användbarheten hos de novo- modellerna för upptäckt av molekyler som reglerar metastasering i sekundära organ och för utvärdering av preklinisk effekt av terapeutiska medel i adjuvansinställningen.

För att kringgå dessa begränsningar utvecklade vi en de novo autochtonmodell av metastaser i mammakarcinom i lungorna. Parentala transgena kvinnor ( dvs. MMTV-PyMT på FVB / n-stammen bakgrunden för studier som beskrivs häri) bärande de novo mammatumörer med sena stadium är åldrade till ~ 100 dagar ⁶ , vid vilken tidpunkt deras primära tumörer kirurgiskt återkallas och enzymatiskt dissocieras till Enkelcellsuspensioner. Suspensioner (1 x 10 ⁶ celler) är i sin tur ortotopiskt explanterades i 6-7 veckor gamla mottagande syngena möss av honkön, där enkel primära brösttumörer utvecklas över en 38-60 dagars period ( <stronG klass = "xfig"> Figur 1A). Vid en definierad tumörstorlek (172 till 450 mm ³ ) bedöms mottagarmössen och primära tumörer resureras kirurgiskt så att tumörgenväxt på operationsplatsen minimeras, i överensstämmelse med operation hos kvinnor ( kompletterande Figur 1 ). På FVB / n-stambakgrunden utvecklar möss histologiskt detekterbara metastatiska foci i lungorna med 45% penetrering av ~ 115 dagar efter operationen ( Figur 1B ). Med denna förlängda latens av metastatisk tumörtillväxt är modellen unikt positionerad för adjuverande terapiavgivning och för att belysa och utvärdera underliggande biologi som påverkar metastatisk progression efter kirurgisk avlägsnande av primära tumörer.

Protocol

Djur som används i följande protokoll omfattas av Oregon Health and Science University Institutionella djurvård och användningskommitté (IACUC), som är utformad för att överensstämma med djurskyddslagen och PHS-riktlinjerna. Underhåll av sterila förhållanden: Steriliserade instrument ska användas och mellan möss ska torkas ren med steril gasbindning, sköljas i PBS följt av sterilisering med desinfektionsmedel 70% etanol i minst 15 minuter. En kirurgisk keps, ansiktsmask, klä…

Representative Results

Större än 75% av mottagande möss som tar emot 1 x 10 ^ celler från primära brösttumörer härledda från MMTV-PyMT-möss utvecklar enskilda bröst adenokarcinom som sträcker sig i storlek från 172 till 450 mm 3 inom 38-60 dagar (data ej visade). Möss som är berättigade till randomisering inskrives sedan i studiegrupper efter kirurgisk resektion av primära tumörer som visas ( Figur 1C ). Primär tumörgenväxt identifierades…

Discussion

Ändringar och felsökning:

När trubbigt dissekerar tumör bort från bukväggen, kan tumören förbli vidhäftande mot bukväggen. Detta observerades hos <5% möss injicerade med tumör (data ej visad). För möss med tumörer som vidhäftar sig i bukväggen, bör musen euthaniseras eftersom resektion är svår utan primär tumörväxt.

Begränsningar av modell / teknik:

Andra undersökare har ra…

Materials

Isofluorane	Piramal Healthcare	N/A	Prescription order
Collagenase A	Roche	11088793001
DNase I	Roche	10104159001
DMEM	ThermoFisher	12634010
25 mL Pyrex bottle	Sigma-Aldrich	CLS139525
Fetal Bovine Serum	Atlanta Bio	S11150
0.7 µm nylon strainer	Corning	352350
50 mL conical tube	VWR	89039-658
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Growth factor-reduced Matrigel	BD	354230	Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma
Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex	Sigma-Aldrich	PVP1
29 gauge 0.3 mL insulin syringe	BD	324702
Small Vessel Cauterizer Kit	FST	18000-00
Wound clips	Texas Scientific	205016
AutoClip wound clip applier	BD	427630
AutoClip wound clip remover	BD	427637
Bromodeoxyuridine	Roche	10280879
Heparinized capillary tubes	Fisher	22362566
Microtainer tubes with dipotassium EDTA	BD	365974
20 mL syringe	BD	309661
DPBS	Thermo-Fisher	14190-250
OCT-freezing medium	VWR	25608930
Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer)	Fisher	SF100-4
23g needle	Fisher	14-826-6B
FVB/n mouse	Jackson Laboratories	001800