Undersøgelse Proteasome Montering med rekombinant arke Proteasomer og denaturerende SIDE: The Case for en kombineret fremgangsmåde
Summary
Denne protokol bruger både subunit coekspression og postlysis underenhed blanding for en mere grundig undersøgelse af rekombinant proteasom forsamling.
Abstract
Proteasomer findes i alle områder af livet. De giver den største rute intracellulær proteinnedbrydning i eukaryoter, selvom deres samling ikke er helt forstået. Alle proteasomer indeholde en strukturelt konserveret kernepartikel (CP), eller 20S proteasom, der indeholder to heptamere p subunit ringe anbragt mellem to heptamere α subunit ringe. Arke 20S proteasomer er deres sammensætning enklere i forhold til deres eukaryote kolleger, men de begge deler en fælles samling mekanisme. Derfor arke 20S proteasomer fortsat være vigtige modeller for eukaryote proteasom forsamling. Specifikt har rekombinant ekspression af arke 20S proteasomer kombineret med ikke-denaturerende polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) gav mange vigtige indsigter i proteasom biogenese. Her diskuterer vi et middel til at forbedre den sædvanlige strategi coekspression af arke proteasom α og p underenheder før nondenaturing PAGE. Vi viser, at selv om hurtig og effektiv, kan en co-ekspression tilgang alene brænde centrale montage mellemprodukter. I tilfælde af proteasomet, kan co-ekspression ikke tillade detektion af den halve proteasomet, et mellemprodukt indeholdende et komplet α-ring og en komplet β-ring. Imidlertid er dette mellemprodukt let påvises via lysat blanding. Vi foreslår, at kombinere co-ekspression med lysat blanding giver en tilgang, der er mere grundig i at analysere forsamling, men forbliver arbejdskraft nonintensive. Denne fremgangsmåde kan være nyttig til undersøgelse af andre rekombinante multiprotein komplekser.
Introduction
Multiprotein komplekser udfører mange kritiske cellulære aktiviteter 1. For mange af disse komplekser, er meget mere viden om deres struktur og funktion end om deres samling 2,3. Proteasomet er et sådant kompleks og findes i alle områder af livet. I eukaryoter, denne molekylære maskine er kernen i Ubiquitin / Proteasome System (UPS) og giver den største rute intracellulær proteinnedbrydning 4. Den eukaryote proteasomet (benævnt 26S proteasomet) består af to store sub enheder: en 20S proteasom eller kernepartiklen (CP) 5, som kan blive udjævnet på en eller begge ender med en 19S Regulatory Particle (RP) 6.
Den 20S proteasomet er en stor ruminddelt protease. Dens kvaternære struktur er helt bevaret på tværs af alle områder af livet og består af en stak af fire syv-leddede ringe indeholdende to typer af strukturelt beslægtede underenheder, α; og p 5,7,8. I eukaryoter, er de to ydre ringe hver består af syv forskellige a-underenheder og to indre ringe omfatter hver syv forskellige p-underenheder; proteolytisk aktivitet bopæl inden tre af p-underenheder. Derimod er CP ringe af archaea og bakterier består sædvanligvis af kun en type α og én type β underenhed. Arke proteasomer har givet et vigtigt modelsystem til at studere proteasom samling på grund af både deres kompositoriske enkelhed og deres deler en fælles samling mekanisme med deres eukaryote modstykker 9-13. Kort fortalt, a-underenheder samles til a ringe første, der tjener som et stillads, på hvilket p underenheder samle. De resulterende halve proteasomer (α 7 β 7) dimeriserer, der giver anledning til fuldt samlet CP (α 7 β 7 β 7 α 7). Under dimerisering, propeptiderne stede på p-underenhederer autokatalytisk fjernes, og udsætter de katalytiske N-terminale threoniner. Anvendelsen af arke proteasomer at modellere samling ofte drager fordel af produktionen af rekombinante arke proteasom proteiner i Escherichia coli. Dette er et værdifuldt fremgangsmåde, fordi den gør det muligt underenhederne, der skal produceres i forskellige kombinationer, som både WT og mutant versioner, i en værtsorganisme, der ikke producerer sine egne proteasomer.
Overvågning samlingen af multi-proteinkomplekser kræver biokemisk eller anden form for fraktionering metode, der adskiller færdigsamlede komplekser fra assembly mellemprodukter og precursorer. På grund af sin overlegne løse kapacitet, ikke-denaturerende polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) har vist sig at være særligt anvendelige i fraktioneringen af forskellige store multiprotein komplekser 14-17. Kombinationen af rekombinant arke proteasom produktion og ikke-denaturerende PAGE er blevet en kraftfuld tilgang dissecting proteasom samling 9,11,12,18. Men den sædvanlige fremgangsmåde, hvorved denne metode anvendes (dvs.. Via rekombinante coekspression af a- og p-underenheder) har en vigtig ulempe. Assembly reaktioner er samarbejdsvillig og stærkt koncentrationsafhængig 3. Da proteinkoncentrationen i celler er meget høj 19, på grund af udelukkede volumen virkninger, assembly reaktioner foregår hurtigt in vivo. Derfor er det muligt at gå glip af vigtige assembly mellemprodukter når a- og p-underenheder er co-udtrykt.
Her vil vi argumentere for en kombineret tilgang i studiet af proteasom samling anvendelse af rekombinante arke proteasom underenheder. I denne fremgangsmåde er både coekspression og lysat blandingsmetoder anvendes. Førstnævnte tillader hurtig analyse af samlingen, fordi co-ekspression er mindre arbejdskrævende. Sidstnævnte afhænger separat ekspression af a- og p-underenheder, efterfulgt af blanding. Selvom dette vandskraveneres en smule mere indsats end co-ekspression, er det mere end opvejes af evnen til at opdage mellemprodukter, der mistede under co-ekspression. Sammen kan de to metoder giver et mere fuldstændigt billede af proteasom forsamling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi demonstrerer fordelen ved en kombineret tilgang til at analysere proteasom samling ved denaturerende PAGE anvendelse af rekombinante arke proteasomer. Den sædvanlige metode 9,11 af bakteriel coekspression af proteasom underenheder muliggør hurtig analyse, men kan ikke afsløre vigtige assembly mellemprodukter. Vi foreslår at kombinere coekspression med lysat blanding at udvikle et bredere billede af montage begivenheder.
Fordelen ved denne kombinerede fremgangsmåde er, at t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet delvist af en Research Support Funds Grant (RSFG) fra Indiana University-Purdue University, Indianapolis, og delvist af en pris fra American Heart Association 14GRNT20390154, til ARK
Materials
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective equipment |
| Amicon ultra 0.5ml centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E.coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized-cobalt affinity resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson, J. R. Cooperativity in macromolecular assembly. Nat Chem Biol. 4, 458-465 (2008).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Génétique. 192, 319-360 (2012).
- Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
- Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
- Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
- Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
- Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W. Critical elements in proteasome assembly. Nat Struct Biol. 1, 765-770 (1994).
- Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
- Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
- Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
- Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1, 418-428 (2006).
- Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
- Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
- Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
- Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
- Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).
