Het onderzoeken van Proteasome Montage met Recombinant Archaea Proteasomen en denaturerende PAGE: The Case voor een gecombineerde aanpak
Summary
Dit protocol maakt gebruik van zowel subunit co-expressie en postlysis subunit mengen voor een grondig onderzoek van recombinant proteasoom montage.
Abstract
Proteasomen worden gevonden in alle domeinen van het leven. Zij bieden de belangrijkste route voor intracellulaire eiwitafbraak in eukaryoten, hoewel hun assemblage wordt niet volledig begrepen. Alle proteasomen bevatten een structureel geconserveerd kerndeeltje (CP) of 20S proteasoom, die twee heptamere β subeenheid ringen tussen twee heptamere ringen α subeenheid. Archaea 20S proteasomen zijn compositorisch eenvoudiger in vergelijking met hun eukaryote tegenhangers, maar ze beiden delen een gemeenschappelijke vergadering mechanisme. Bijgevolg Archaea 20S proteasomen blijven belangrijke modellen voor eukaryote proteasoom montage zijn. Specifiek heeft recombinante expressie Archaea 20S proteasomen gekoppeld denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) veel belangrijke inzichten proteasoom biogenese opgeleverd. Hier bespreken we een manier te verbeteren op de gebruikelijke strategie van co-expressie van archaea proteasoom α en ß-subeenheden voorafgaand aan nondenaturing PAGE. We laten zien dat hoewel snel en efficiënt, een co-expressie aanpak alleen kan missen belangrijke assemblage tussenproducten. Bij het proteasoom, kan co-expressie geen detectie van de half-proteasoom, een tussenproduct dat een volledige α-ring en een volledige β-ring mogelijk. Echter, dit tussenproduct wordt gemakkelijk gedetecteerd via lysaat mengen. Wij stellen voor dat de combinatie van co-expressie met lysaat mengen een aanpak die is grondiger in het analyseren van de montage oplevert, maar toch blijft arbeid nonintensive. Deze benadering kan nuttig zijn voor het bestuderen van andere recombinante multiproteïnecomplexen zijn.
Introduction
Multiproteïnecomplexen uit te voeren tal van kritische cellulaire activiteiten 1. Voor veel van deze complexen, meer bekend over hun structuur en functie dan ongeveer 2,3 de montage. Het proteasoom is zo'n complex en wordt in alle domeinen van het leven. In eukaryoten, deze moleculaire machine is de kern van het ubiquitine / Proteasome System (UPS) en geeft de belangrijkste route van intracellulaire eiwitafbraak 4. De eukaryote proteasoom (aangeduid als 26S proteasoom) bestaat uit twee belangrijke subassemblages: a 20S proteasoom of kerndeeltje (CP) 5, die kunnen worden afgesloten aan één of beide einden door een 19S Regulatory Particle (RP) 6.
Het 20S proteasoom is een groot gecompartimenteerd protease. De quaternaire structuur absoluut geconserveerd in alle levensdomeinen en bestaat uit een stapel van vier zevenringen die twee soorten structureel verwante subeenheden, α; en P 5,7,8. In eukaryoten worden de twee buitenringen elk bestaande uit zeven verschillende α subeenheden en twee binnenringen elk bestaan uit zeven verschillende β subeenheden; proteolytische activiteit berust bij drie van de β subeenheden. Daarentegen worden de CP ringen archaea en bacteriën gewoonlijk samengesteld uit slechts één type α en één type β subunit. Archaea proteasomen hebben verstrekt een belangrijk model systeem om proteasoom assemblage studeren als gevolg van zowel hun compositorische eenvoud en het delen van een gemeenschappelijke vergadering mechanisme met hun eukaryote tegenhangers 9-13. Kortom, α subeenheden assembleren in α ringen eerste, die dienen als een stellage waarop ß-subeenheden assembleren. De resulterende half-proteasomen (α β 7 7) dimeriseren, wat tot volledig geassembleerd CP (α β 7 7 7 α β 7). Dimerisatie tijdens de propeptiden in over ß-subeenhedenautokatalytische worden verwijderd, waardoor de katalytische N-terminale threoninen. Het gebruik van proteasomen Archaea montage model houdt vaak gebruik van de productie van recombinante archaea proteasoom eiwitten in Escherichia coli. Dit is een waardevolle benadering omdat het stelt de subeenheden worden geproduceerd in verschillende combinaties, zowel WT en mutante versies in een gastheerorganisme dat zijn eigen proteasomen niet produceert.
Monitoring van de assemblage van multi-eiwitcomplexen biochemisch vereist enige vorm van fractionering methode die volledig gemonteerd complexen van assemblage tussenproducten en voorlopers scheidt. Vanwege de superieure oplossen capaciteit denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) gebleken bijzonder bruikbaar bij de fractionering van diverse grote multiproteïnecomplexen 14-17 zijn. De combinatie van recombinant archaea proteasoom productie en denaturerende PAGE is uitgegroeid tot een krachtige aanpak in dissecting proteasoom montage 9,11,12,18. De gebruikelijke wijze waarop deze benadering wordt toegepast (bijv. Via de co-expressie van recombinant α en β-subeenheden) een belangrijk nadeel. Vergadering reacties zijn coöperatieve en sterk afhankelijk van de concentratie 3. Aangezien de eiwitconcentratie in cellen is zeer hoog 19 vanwege uitgesloten volume-effecten, assemblage reacties verlopen in vivo snel. Daarom is het mogelijk om belangrijke assemblage tussenproducten missen als α en β subeenheden co-expressie gebracht.
Hier, we pleiten voor een gecombineerde aanpak in het onderzoek naar proteasoomafhankelijke assemblage het gebruik van recombinante Archaea proteasoom subunits. In deze benadering worden zowel co-expressie en lysaat mengmethoden gebruikt. De voormalige zorgt voor een snelle analyse van de montage, omdat co-expressie is minder arbeidsintensief. De laatste is afhankelijk van afzonderlijke expressie van α en β-subeenheden, gevolgd door mengen. Hoewel dit requires met enige moeite dan co-expressie is meer dan gecompenseerd door de mogelijkheid om tussenproducten die worden gemist tijdens co-expressie te detecteren. Samen kunnen deze twee methoden een vollediger beeld proteasoomafhankelijke samenstel.
Protocol
Representative Results
Discussion
We tonen het voordeel van een gecombineerde aanpak van het analyseren van proteasoom montage door denaturerende PAGE met behulp van recombinant Archaea proteasomen. De gebruikelijke methode 9,11 van bacteriële co-expressie van proteasoom subunits zorgt voor een snelle analyse, maar kan niet onthullen sleutel assemblage tussenproducten. We raden het combineren van co-expressie met lysaat mengen tot een breder beeld van de montage evenementen te ontwikkelen.
Het voordeel van deze g…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund in het kader van een onderzoek fondsen ter ondersteuning van Grant (RSFG) van de Universiteit van Indiana-Purdue University, Indianapolis, en deels door een onderscheiding van de American Heart Association 14GRNT20390154, om ARK
Materials
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective equipment |
| Amicon ultra 0.5ml centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E.coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized-cobalt affinity resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson, J. R. Cooperativity in macromolecular assembly. Nat Chem Biol. 4, 458-465 (2008).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Génétique. 192, 319-360 (2012).
- Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
- Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
- Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
- Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
- Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W. Critical elements in proteasome assembly. Nat Struct Biol. 1, 765-770 (1994).
- Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
- Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
- Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
- Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1, 418-428 (2006).
- Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
- Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
- Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
- Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
- Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).
