एक संयुक्त दृष्टिकोण के लिए प्रकरण: संयोजक अर्चेअल Proteasomes और Nondenaturing पेज के साथ Proteasome विधानसभा की जांच
Summary
इस प्रोटोकॉल दोनों सबयूनिट Coexpression और postlysis सबयूनिट पुनः संयोजक एंटीबॉडी विधानसभा का एक और अधिक पूरी तरह से परीक्षा के लिए मिश्रण का उपयोग करता है।
Abstract
Proteasomes जीवन के सभी क्षेत्रों में पाए जाते हैं। वे eukaryotes में intracellular प्रोटीन गिरावट का प्रमुख मार्ग प्रदान करते हैं, हालांकि उनके विधानसभा पूरी तरह से समझ नहीं है। सभी proteasomes, एक संरचनात्मक रूप से संरक्षित कोर कण (सीपी), या 20S एंटीबॉडी शामिल दो heptameric β सबयूनिट दो heptameric α सबयूनिट के छल्ले के बीच sandwiched छल्ले हैं। अर्चेअल 20S proteasomes उनकी यूकेरियोटिक समकक्षों की तुलना में compositionally सरल कर रहे हैं, फिर भी वे दोनों एक आम विधानसभा तंत्र का हिस्सा है। नतीजतन, अर्चेअल 20S proteasomes यूकेरियोटिक एंटीबॉडी विधानसभा के लिए महत्वपूर्ण मॉडल होना जारी है। विशेष रूप से, अर्चेअल 20S nondenaturing जेल वैद्युतकणसंचलन (पृष्ठ) के साथ मिलकर proteasomes की पुनः संयोजक अभिव्यक्ति एंटीबॉडी जीवजनन में कई महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्राप्त हुए है। यहाँ, हम अर्चेअल एंटीबॉडी α के Coexpression के सामान्य रणनीति पर सुधार करने के लिए एक साधन के बारे में चर्चा और nondenaturi को बीटा सब यूनिटों से पहलेएनजी पृष्ठ। हम जानते हैं कि हालांकि तेजी से और कुशल, एक Coexpression अकेले दृष्टिकोण महत्वपूर्ण विधानसभा मध्यवर्ती याद कर सकते हैं प्रदर्शित करता है। एंटीबॉडी के मामले में, Coexpression आधा एंटीबॉडी का पता लगाने, एक मध्यवर्ती युक्त एक पूरा α अंगूठी और एक पूरा β-अंगूठी अनुमति नहीं हो सकती। हालांकि, इस मध्यवर्ती आसानी से lysate मिश्रण के माध्यम से पता चला है। हमारा सुझाव है कि lysate मिश्रण के साथ Coexpression संयोजन एक दृष्टिकोण है कि विधानसभा का विश्लेषण करने में और अधिक गहन है पैदावार, अभी तक श्रम nonintensive बनी हुई है। यह दृष्टिकोण अन्य पुनः संयोजक multiprotein परिसरों के अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है।
Introduction
Multiprotein परिसरों कई महत्वपूर्ण सेलुलर गतिविधियों 1 बाहर ले। इन परिसरों से कई के लिए, बहुत अधिक उनके विधानसभा 2,3 के बारे में की तुलना में उनकी संरचना और समारोह के बारे में जाना जाता है। एंटीबॉडी एक ऐसी जटिल है और जीवन के सभी क्षेत्रों में पाया जाता है। Eukaryotes में, यह आणविक मशीन Ubiquitin / Proteasome प्रणाली (यूपीएस) के मूल में है और intracellular प्रोटीन गिरावट 4 के प्रमुख मार्ग प्रदान करता है। यूकेरियोटिक एंटीबॉडी (26S एंटीबॉडी के रूप में) के दो प्रमुख उप असेंबलियों के शामिल है: एक 20S एंटीबॉडी, या कोर कण (सीपी) 5, कि एक 19S नियामक कण (आरपी) 6 से एक या दोनों सिरों पर छाया हुआ जा सकता है।
20S एंटीबॉडी एक बड़ी बंटे प्रोटीज है। इसके चतुर्धातुक संरचना पूरी तरह से जीवन के सभी डोमेन में संरक्षित और चार से सात अंग का संरचनात्मक रूप से संबंधित सब यूनिटों के दो प्रकार युक्त छल्ले के एक ढेर के होते है, α; और 5,7,8 बीटा। eukaryotes में, दो बाहरी छल्ले प्रत्येक सात अलग α सब यूनिटों के शामिल हैं और दो भीतर के छल्ले प्रत्येक सात अलग β सब यूनिटों के शामिल हैं, प्रोटिओलिटिक गतिविधि β सब यूनिटों में से तीन के भीतर रहता है। इसके विपरीत, जीव और जीवाणु के सीपी के छल्ले आमतौर पर α का ही एक प्रकार है और β सबयूनिट का एक प्रकार के शामिल हैं। अर्चेअल proteasomes उनकी compositional सादगी और उनके समकक्षों उनकी यूकेरियोटिक 9-13 के साथ एक आम विधानसभा तंत्र को साझा करने के लिए दोनों के कारण एंटीबॉडी विधानसभा अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली प्रदान की है। संक्षेप में, α सब यूनिटों पहले α छल्ले में इकट्ठा है, जो एक पाड़ पर जो बीटा सब यूनिटों को इकट्ठा के रूप में सेवा करते हैं। जिसके परिणामस्वरूप आधा proteasomes (α 7 β 7) dimerize, जन्म देने के लिए पूरी तरह से सीपी (α 7 β 7 β 7 α 7) इकट्ठे करने के लिए। dimerization के दौरान, propeptides बीटा सब यूनिटों पर पेशautocatalytically हटा रहे हैं, उत्प्रेरक एन टर्मिनल threonines उजागर। अर्चेअल proteasomes के उपयोग के विधानसभा मॉडल करने के लिए अक्सर कोलाई में पुनः संयोजक अर्चेअल एंटीबॉडी प्रोटीन के उत्पादन का लाभ लेता है। यह एक सार्थक दृष्टिकोण है, क्योंकि यह सब यूनिटों विभिन्न संयोजनों में उत्पादित करने के लिए सक्षम बनाता है, दोनों WT और उत्परिवर्ती संस्करणों के रूप में, एक मेजबान जीव है कि अपनी ही proteasomes का उत्पादन नहीं करता है।
बहु-प्रोटीन परिसरों की विधानसभा निगरानी biochemically विभाजन तरीका है कि विधानसभा मध्यवर्ती और व्यापारियों से पूरी तरह से इकट्ठे परिसरों को अलग से किसी तरह की आवश्यकता है। अपनी बेहतर हल करने की क्षमता है, nondenaturing जेल वैद्युतकणसंचलन (पृष्ठ) के कारण विभिन्न बड़े multiprotein परिसरों 14-17 के विभाजन में विशेष रूप से उपयोगी साबित हो गया है। पुनः संयोजक अर्चेअल एंटीबॉडी उत्पादन और nondenaturing पेज के संयोजन dissectin में एक शक्तिशाली दृष्टिकोण बन गया हैजी एंटीबॉडी विधानसभा 9,11,12,18। हालांकि, सामान्य विधि है जिसके द्वारा इस दृष्टिकोण लागू किया जाता है (यानी। Α और β सब यूनिटों की पुनः संयोजक Coexpression के माध्यम से) एक महत्वपूर्ण खामी है। विधानसभा प्रतिक्रियाओं सहकारी और दृढ़ता से एकाग्रता पर निर्भर 3 रहे हैं। यह देखते हुए कि प्रोटीन एकाग्रता कोशिकाओं के अंदर बाहर रखा मात्रा प्रभाव की वजह से, बहुत अधिक 19 है, विधानसभा प्रतिक्रियाओं विवो में तेजी से आगे बढ़ें। इसलिए यह महत्वपूर्ण विधानसभा मध्यवर्ती याद आती है जब α और β सब यूनिटों coexpressed कर रहे हैं संभव है।
यहाँ, हम पुनः संयोजक अर्चेअल एंटीबॉडी सब यूनिटों का उपयोग कर एंटीबॉडी विधानसभा के अध्ययन में एक संयुक्त दृष्टिकोण के लिए तर्क है। इस दृष्टिकोण में, दोनों Coexpression और lysate मिश्रण तरीकों कार्यरत हैं। क्योंकि Coexpression कम श्रम गहन पूर्व विधानसभा के तेजी से विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। उत्तरार्द्ध α और β सब यूनिटों, मिश्रण द्वारा पीछा अलग अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। इस requi हालांकिres Coexpression की तुलना में थोड़ा और अधिक प्रयास, इसके लिए मुआवजा की तुलना में अधिक मध्यवर्ती कि Coexpression के दौरान याद कर रहे हैं पता लगाने की क्षमता से है। साथ में, इन दो तरीकों एंटीबॉडी विधानसभा की एक और पूरी तस्वीर प्रदान कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम पुनः संयोजक अर्चेअल proteasomes का उपयोग कर पृष्ठ nondenaturing द्वारा एंटीबॉडी विधानसभा का विश्लेषण करने के लिए एक संयुक्त दृष्टिकोण का लाभ प्रदर्शित करता है। एंटीबॉडी सब यूनिटों के जीवाणु Coexpression की सामान्य विधि <…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन 14GRNT20390154 से एक पुरस्कार से एक अनुसंधान सहायता निधि अनुदान (RSFG) इंडियाना विश्वविद्यालय, पर्ड्यू विश्वविद्यालय, इंडियानापोलिस से द्वारा समर्थित किया गया था, और भाग में, सन्दूक के लिए
Materials
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective equipment |
| Amicon ultra 0.5ml centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E.coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized-cobalt affinity resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson, J. R. Cooperativity in macromolecular assembly. Nat Chem Biol. 4, 458-465 (2008).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Génétique. 192, 319-360 (2012).
- Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
- Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
- Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
- Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
- Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W. Critical elements in proteasome assembly. Nat Struct Biol. 1, 765-770 (1994).
- Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
- Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
- Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
- Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1, 418-428 (2006).
- Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
- Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
- Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
- Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
- Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).
